酶测定法实验

材料与设备

核心 RNA 聚合酶 (2.3 mg/ml)

纯σ³² 标准品 (0.8 mg/ml)

纯化的 σ³² 样品，由 POROS 50S 阳离子交换柱洗脱所得

核心 RNA 聚合酶-σ³² 复合物样品，由免疫亲和柱洗脱所得

[α-³²P]UTP（ 用 2.5uCi/ml 的反应液)

水浴，设定 37°C

终止液 (0.2mol/LEDTA)

DEAE-纤维素（DE81) 纸片

P04 清洗缓冲液（5%Na2 HP04)

乙醇（95%)

试剂

反应液

(配方，见“试剂的配制”，PP.184~189)

搡作程序

1) 用吸管取 50-ul 等分反应液（含 2.5uCi[α-³²P]UTP/ml) 加入置于冰上的各试管。

2) 各加入 5ul 适当稀释的σ32 样品，混匀。一个样品应是标准制备物, 另一个样品应是由免疫亲和柱洗脱所得的核心 RNA 聚合酶-σ³² 复合物。还应确保有一个“不含σ³²”的空白对照以测定只有核心 RNA 聚合酶的掺入量，及一个“未孵育”的空白对照（加终止液于置冰上的试管, 但不在 37°C 孵育) 以测定本底。

3) 除含核心 RNA 聚合酶-σ³² 复合物的各管和含纯σ32 标准的一管外，其佘各管均加 5ul 稀释的核心 RNA 聚合酶（总量 1ug)。

4) 各管 37°C 孵育 10 min 后，加 10ul 终止液终止反应。

5) 取各管反应液 25ul, 分别点在 DEAE-纤维素纸片上。

6) 将纸片放入烧杯，用预冷的 P04 清洗缓冲液洗 4 次，每次 100 ml 洗 5 min。前两次的清洗液倒入放射性废液容器。最后，分别用只 H₂0 和 95% 乙醇各洗一次。

7) 干燥纸片，进行放射性计数。

8) 对每个σ³² 样品，取掺入量（已减去“未孵育”空白对照的本底对其加样量作图。确定每个样品相对于已知σ³² 标准的活性。裉据每个样品的蛋白浓度，即可计算出相对比活性。
注：的另一活性是它与核心 RNA 聚合酶的结合能力。对此，可用非变性凝胶电泳分析核心 RNA 聚合酶转化为核心 RNA 聚合酶-σ³² 复合物的情况来测定，如本单元实验 5 所述（PP.169~171)。