利用流式细胞术分析细胞周期时相

一、实验目的

掌握流式细胞仪的工作原理

掌握用流式细胞仪测量细胞群体DNA含量分布的方法

了解流式细胞术在细胞生物学研究中的应用

二、实验原理

流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。

细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如G0/G1期的DNA含量为2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。

三、仪器、材料与试剂

仪器：流式细胞仪，细胞培养设备，离心机，水浴，冰箱

材料：HeLa细胞，5ml注射器，离心管，封口膜，微量移液器，Tips

试剂：70％乙醇（保存于4℃），RNase-A （10mg/ml,-20℃保存）

PI （650µg/ml，避光保存于-20℃），PBS(pH 7.4，保存于4℃)

四、实验步骤

1、取对数生长期细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，800rpm , 离心 15 min去上清。

2、PBS洗2次，加0.5mL PBS吹匀，务必吹散。

3、用5mL注射器将细胞吸起，用力打入5mL 70%(预冷)乙醇中，封口膜封口。4℃固定过夜（可长至2周）

4、800rpm 15min收集固定细胞，PBS洗2

5、用0.4mL PBS重悬细胞并转至Tube中轻轻吹打（防止细胞破碎）

6、加RNase-A约3µL至终浓度约为50µg/mL ，37℃水浴消化30 min；

7、加PI约50µL至终浓度约为65µg/mL ，在冰浴中避光染色30 min。

8、用300目（孔径40~50微米）尼龙网过滤，上机检测

9、样品分析测定及打印。