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        利用肽底物分析CaMKⅠ和Ⅱ

        相关实验:用肽底物检测蛋白质激酶的活性和特异性实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1. 准备 P81 磷酸纤维素滤纸。

        (1) P81 磷酸纤维素滤纸切成 2cmX2cm 的方块,折起一个角,用铅笔在这里做个记号。

        (2) 将膜块放在一大张非吸收性材料上,如有机玻璃或者盖着铝箔的纤维板。

        2. 设置和标记进行分析反应的离心管。

        反应体积可以是 25~100 μl。对于 50 μl 反应,加入下列溶液:

        10X 反应缓冲液                                     5 μl

        10X 底物溶液                                         5 μl

        水                                                         0~34 μl

        10X ATP                                                5 μl

        激酶样品,如纯化的激酶或细胞裂解物     1~35 μl

        3. 制备合成的肽底物(一般是 10 mmol/L 的 10X 肽底物溶液)。

        (1) 用 Milli-Q 纯化的水溶解适量的肽,配成 10 mmol/L 的溶液。

        (2) 肽溶液在保存或使用前将 pH 调至 pH 7.4。大多数肽保存于 -70℃ 很稳定。然而对于个别的肽底物必须检测在保存条件下的稳定性。

        4. 将激酶样品除外的其他反应成分加入进行反应的离心管。

        5X CaMK 分析缓冲液                                 10 μl

        10 mmol/L CaMK 肽底物溶液                      5 μl

        [γ-32P] ATP(终浓度 5 μCi/5 μmol/L ATP)     5 μl

        100 μg/ml 钙调蛋白或水                              5 μl

        水(取决于下一步所加的激酶样品的量)      0~25 μl

        5X CaMK 分析缓冲液:

        100 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)

        25 mmol/L MgCl2

        1 mmol/L CaCl2

        钙调蛋白储存液(Calbiochem)

        1 mg/ml,溶于 Milli-Q 纯化的水

        分成小份,-70℃ 保存

        5. 盖上离心管,加入始发反应物前加热至 30℃,维持 5 分钟。

        6. 每 30 秒依次往置于 30℃ 预热的反应管加入 1~25 μl 激酶样品启动反应。

        7. —旦达到所需的实验时间,迅速从每管吸出 30 μl 反应产物到切成小方块的 P81 滤纸上。立即将 P81 滤纸放入装着 75 mmol/L 正磷酸的烧杯。

        8. 5 分钟后,将磷酸倒入收集 32P 废液的容器。再加入 75 mmol/L 正磷酸,搅拌 5 分钟以上。如此冲洗 P81 滤纸 5 次。

        9. 加入丙酮,清洗 5 分钟。倒去丙酮,让膜自然晾干。

        10. 将每张 P81 滤纸放入一个 20 ml 的液闪计数管,用液闪计数器测定放射性。

        来源:丁香实验

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