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        间接免疫荧光法测抗体

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        12634
        一、基本原理:

        染色程序分为两步,第一步,用未知未标记的抗体(待检标本)加到已知抗原标本上,在湿盒中37℃保温30 min,使抗原抗体充分结合,然后洗涤,除去未结合的抗体。第二步,加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG. IgM抗体。如果第一步发生了抗原抗体反应,标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合,从而可鉴定未知抗体。

        二、试剂与仪器:

        1. 磷酸盐缓冲盐水(PBS):0.01 mol/L,pH7.4。

        2. 缓冲甘油:分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2,0.2 M碳酸盐缓冲液1份配制。

        3. 荧光标记的抗人球蛋白抗体:以0.01 mol/L,pH7.4的PBS进行稀释。

        4. 搪瓷桶三只(内有0.01 mol/L,pH7.4的PBS 1500 ml)。

        5. 有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸湿的纱布垫)。

        6. 荧光显微镜。

        7. 玻片架。

        8. 滤纸。

        9. 37℃温箱等。

        三、 实验步骤:

        1. 滴加0.01 mol/L,pH7.4的PBS于已知抗原标本片,10min后弃去,使标本片保持一定湿度。

        2. 滴加以0.01 mol/L,pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本,覆盖已知抗原标本片.将玻片置于有盖搪瓷盒内,37℃保温30 min。

        3. 取出玻片,置于玻片架上,先用0.01 mol/L,pH7.4的PBS冲洗1-2次,然后按顺序过0.01 mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸5min,不时振荡 。

        4. 取出玻片,用滤纸吸去多余水分,但不使标本干燥,滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。

        5. 将玻片平放在有盖搪瓷盒内,37℃保温30 min。

        6. 重复操作3。

        7. 取出玻片,用滤纸吸去多余水分,滴加一滴缓冲甘油,再覆以盖玻片。

        8. 荧光显微镜高倍视野下观察,结果判定同直接法。

        四、注意事项:

        1. 荧光染色后一般在1 h内完成观察,或于4℃保存4 h,时间过长 ,会使荧光减弱。

        2. 每次试验时 ,需设置以下三种对照:

        (1)阳性对照:阳性血清+荧光标记物。

        (2)阴性对照:阴性血清+荧光标记物。

        (3)荧光标记物对照:PBS+荧光标记物。

        3. 已知抗原标本片需在操作的各个步骤中,始终保持湿润,避免干燥。

        4. 所滴加的待检抗体标本或荧光标记物,应始终保持在已知抗原标本片上,避免因放置不平使液体流失,从而造成非特异性荧光染色

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