迟发型变态反应（DTH）检测：耳肿胀法

一、原理

二硝基氟苯（DNFB）是一种半抗原，将其稀释液涂抹腹壁皮肤后，与皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。4～7天后再将其涂抹于耳部，使局部产生迟发型变态反应。一般在抗原攻击后24～48h达高峰，故于此时测定其肿胀程度。

二、材料

DNFB、丙酮、麻油、硫化钡、打孔器。

三、实验步骤

1、试剂配制

DNFB溶液 DNFB溶液应新鲜配制，称取DNFB50mg，置清洁干燥小瓶中，将预先配好的5mL丙酮麻油溶液（丙酮：麻油=1：1），倒入小瓶，盖好瓶塞并用胶布密封。混匀后，用250μL注射器通过瓶盖取用。

2、致敏

每鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约3cm×3cm、用DNFB 溶液50μL均匀涂抹致敏。

3、DTH的产生与测定

5天后，用DNFB 溶液10μL 均匀涂抹于小鼠右耳（两面）进行攻击。攻击后24h 颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8mm的耳片，称重。

四、数据处理与结果判定

一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

左右耳重量之差表示DTH的程度。受试样品组的差值显著高于与对照组的差值，可判定该项实验结果阳性。

五、注意事项

操作时应避免DNFB与皮肤接触。