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        HUVEC分离培养

        互联网

        6733

        溶液以及器材:

        1、用RPMI-1640配I型胶原酶 0.1g/100ml

        2、配三抗:

        青霉素:100ku/L

        链霉素:100ku/L

        庆大霉素:100ku/L

        3、培养液(M199+ECGS[3ug/ml]+15%胎牛血清)有EGF可以适当加点10ng/ml

        4、大瓶生理盐水

        5、广口瓶(脐带数+1)

        6、止血钳(脐带数×2+2)

        7、大针头数个(用于吸取生理盐水,胶原酶)

        8、手术剪刀数把

        使用前器械高温蒸气灭菌。

        实验步骤:

        1、去妇产科取当天新鲜脐带(广口瓶;生理盐水),试验前放入4度冰箱。

        2、辨别脐带静脉(粗大的那根),顺着静脉瓣插入大针头,注入生理盐水,充分冲洗脐静脉,至流出液体中无可见血液。

        3、夹住脐带下端,从上端灌注0.1%的胶原酶,钳住脐静脉上端,37度孵育15分钟(已经足够);如果消化液中出现絮状物,说明消化时间过长。

        4、收集消化液,并用含小牛血清的RPMI-1640 冲洗脐静脉,冲洗液并入消化液中。1000-1500转离心10分钟。

        5、将细胞悬浮于培养液中(一根脐带一般可以一个培养瓶,如果细胞少就六孔板一个孔),细胞不能太稀疏,否则生长缓慢。

        6、正常情况下三天长满传代,正常的内皮细胞长满后如同卵石状。

        7、使用前运用标记因子CD31或VIII因子对内皮细胞进行鉴定。

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