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        请问大家怎么做好Transwell分离培养?

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        晓雨知春来


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        4 个回答

        user-title

        土井挞克树

        有帮助

        1.

        细胞悬液 200µl 加入 Transwell 小室(肿瘤细胞数目需要摸浓度,从 2 万,5 万,10 万)。

        2.

        24 孔板下室一般加入 600µl 含 15%FBS 的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失。在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

        3.

        养细胞:常规培养 12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)

        user-title

        huarenqiang5

        有帮助

        实验步骤:

        实验前准备:transwell 小室(一般选12um),24 孔板,基质胶(corning),细胞实验所需的基本的材料。

        1、基质胶铺板

        用 Matrigel 1:8 稀释(可以直接用无血清的培养基稀释),包被 Transwell 小室底部膜的上室面,置 37℃孵箱 1-4h 使 Matrigel 聚合成凝胶。

        注意事项:

        1). 铺胶之前将枪头以及所用的耗材至于冰箱 4 度当中,否则配胶的时候会直接凝固。

        2). 铺胶的厚度自己摸索,25ul,40ul,100ul。

        3). 注意铺胶过程不要产生气泡,铺胶均匀,否则影响实验结果。

        4). 注意无菌操作。

        2、制作细胞悬液

        1). 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿 12-24h,进一步去除血清的影响。

        2). 消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用 PBS 洗 1-2 遍,这一步很必要,否则细胞表面覆有血清培养基,细胞没有迁移侵袭的动力),用无血清培养基重悬。

        3、接种细胞

        1). 细胞悬液 200µl 加入 Transwell 小室(肿瘤细胞数目需要摸浓度,从 2 万,5 万,10 万)。

        2). 24 孔板下室一般加入 600µl 含 15%FBS 的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失。在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

        3). 养细胞:常规培养 12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。24h 较常见,时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。

        4、固定染色

        取出 Transwell 小室,弃去孔中培养液,用无钙的 PBS 洗 2 遍,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,甲醇或者甲醛固定 30 分钟,将小室适当风干。用 0.1% 结晶紫染色 30-60 min,用 PBS 洗 3 遍。用棉签轻轻擦掉上室水分。

        5、计数

        400 倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数。


        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        要做好Transwell分离培养,以下是一些建议:

        1. 准备Transwell装置:确保Transwell装置(也称为Transwell孔板或细胞迁移孔板)是清洁的,并在使用前进行灭菌处理。检查Transwell滤膜是否完好无损,无污染。

        2. 细胞准备:根据你的实验目的,培养和准备需要的细胞类型。注意选择合适的细胞密度和培养基来确保细胞在Transwell装置中的适当生长和迁移。

        3. 预处理Transwell滤膜:根据具体实验需求,预处理Transwell滤膜。例如,你可以在Transwell滤膜上涂布基底膜成分、胶原蛋白或其他适当的涂层物质,以促进细胞附着和迁移。

        4. 细胞接种:将培养好的细胞悬液均匀地加入Transwell孔的上室(上腔),根据需要的细胞数目和实验设计确定接种量。

        5. 添加培养基:在Transwell下室(下腔)中添加适当的培养基。这样,细胞将在上室和下室之间建立一个物理障栅,可以通过Transwell滤膜进行细胞迁移。

        6. 培养条件:将Transwell装置放置在细胞培养箱中,并提供适当的培养条件,如温度、湿度和CO2浓度。根据你的实验需求和细胞类型,确定适当的培养时间。

        7. 实验结束和分析:在培养结束后,可以通过分离Transwell装置,进行细胞的染色、显微观察或其他相关实验。根据你的实验目的,进行合适的细胞分析和数据处理。

        user-title

        dxyc42u

        有帮助

        在开始消化铺板之前,我们需要给Transwell小室提前铺上人工基质胶,人工基质胶与coatingbuffer的比例为1:40,混好人工基质胶后加入Transwell小室中,再把Transwell小室放入深孔24孔板中一起放进细胞培养箱赙育2小时。

        孵育结束后用移液器把多余的人工基质胶吸出弃掉,再用相应的纯培养基清洗两道三次,去除残余的人工基质胶。

        接着我们对细胞进行铺板,用胰蛋白酶消化液把贴壁细胞消化下来,吹打混匀后上细胞计数仪进行细胞计数。Transwell小室里面我们铺上10万个细胞,并且保证小室内为无血清培养基0.2 ml,在放置Transwell小室的深孔24孔板中加入700微升的带有血清的完全培养基,血清就起到了趋化因子的作用可以使得细胞从Transwell小室的无血清环境中,迁移到24孔板有血清的环境中。

        根据不同细胞的迁移情况选择在24-48小时取出Transwell小室,去细胞进行后续处理。首先,取出小室后用PBS清洗几遍,动作要轻柔避免人为因素导致细胞脱落。接着用棉签擦去小室上未穿过去的细胞,再次用PBS清洗干净,紧接着把小室放入甲醇中固定15-20分钟,防止细胞在染色冲洗时脱落。

        固定结束后也要用PBS清洗去除甲醇的影响,清洗后把Transwell小室放入终浓度为0.1%的结晶紫染液中染色半个小时,然后再把染色液用流水冲洗干净。最后把冲洗好的小室放在显微镜下观察拍照。

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