生物分子类实验室常用实验技术原理汇总
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足印法（Footprinting）是一种用来测定DNA-蛋白质专一性结合的方法，用于检测目的DNA序列与特定蛋白质的结合，也可展示蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合。其原理为：DNA和蛋白质结合后，DNA与蛋白的结合区域不能被DNase（脱氧核糖核酸酶）分解，在对目的DNA序列进行检测时便出现了一段无DNA序列的空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸数目及其核苷酸序列。
三、染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）
染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别 反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化及鉴定。
基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。
五、高效液相色谱（HPLC）
六、噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。
噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。
七、RNA提取（Trizol法）
八、RT-PCR
1. RNA的提取；
2. 反转录合成cDNA；
3. PCR扩增；
4. 产物的电泳和结果的测定。
九、实时荧光定量PCR（Q—PCR）（Real-time Quantitative PCR ）
C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数。
十、大肠杆菌感受态细胞（E.coli DH5α）制备
1. 前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37 ℃摇床培养过夜（约16小时）；
2. 取1 ml过夜培养物转接于100 ml LB培养基中，在37 ℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300 rpm）；
3. 将0.1 M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作；
4. 吸取1.5 ml培养好的菌液至1.5 ml离心管中，在冰上冷却10分钟；
5. 4 ℃下3000 g冷冻离心5分钟；
6. 弃去上清，加入100微升预冷0.1 M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；
7. 4 ℃下3000 g冷冻离心5分钟；
8. 弃去上清，加入100微升预冷0.1 M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；
9. 细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70 ℃）。
十一、碱变性提取质粒DNA
十二、目的基因的连接、转化及克隆筛选
（1）总过程：
（2）分---PCR分离目的基因：
PCR克隆、同源克隆、文库筛选
（3）切---限制性内切酶切割：
粘性末端、平末端
（4）接---目的基因与载体相连
（5）转---转入宿主细胞
（6）筛---筛选阳性重组体
十三、RNA干扰（RNAi）
十四、cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术
十五、mRNA差异显示技术（DD-PCR）
十六、抑制差减杂交
抑制差减杂交技术原理抑制差减杂交技术(SSH)是由Diatchenko等建立的以抑制性PCR和DNA差减杂交方法相结合的方法。其依据的主要技术有两点：（1）消减杂交;
（2）抑制PCR。经抑制差减杂交后的cDNA群体不仅富集了差异表达基因(目的基因),而且目的基因间丰度的差异经过均等化作用已基本消除,使消减后的cDNA群体为丰度一致的目的基因群体。
抽提两种不同来源组织的mRNA(tester和driver),反转录成 cDNA,用4碱基识别酶(RsaI)或HaeIII酶切两种cDNA产生平端片段;将testerc DNA分成均等的两份,分别接上dapter1和adapter2两种接头,并与过量的经RsaI消化的driver样本变性后退火杂交。第一次杂交后有4种产物:a是单链testercDNA;b是自身退火的testercDNA双链;c是tester和driver的异源双链;d是drivercDNA。
二十五、酶联免疫吸附测定（ELISA）
具体实验：http://www.biomart.cn/experiment/88.htm
二十七、mRNA的分离与纯化（寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA）
具体实验：http://www.biomart.cn/experiment/798.htm
二十八、His-tag纯化蛋白
二十九、RNA酶保护试验方法 (RNase Protection Assay，RPA)
1. 检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。
2. 由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。
3. 由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。
4.步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。
5. RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。
6. 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。
7. 检测分子长度可以任意设置，灵活性大。RPA的缺点是需要同位素标记探针。
三十、免疫组化
三十一、各种分子标记技术的比较
具体实验：http://www.biomart.cn/experiment/201.htm
具体实验：http://www.biomart.cn/experiment/20.htm
具体实验：http://www.biomart.cn/experiment/200.htm
三十二、核糖体谱技术
构建核糖体谱的一般实验法和数据处理流程如下：
b. 用核糖核酸酶处理细胞提取物可以酶解未被核糖体保护的 mRNA 片段，然后回收被核糖体保护的 mRNA 片段，蔗糖密度梯度离心法分离核糖体和mRNA 片段． 将核糖体保护的片段定量地转化为可被深度测序的 cDNA 文库.测序法与转录本测序类似．
c. 测序读段的定位．参考序列一般来自于UCSC Known Genes database 或 利用 UCSC Table Browser 生成相应的参考序列． 其他来源的基因组注释 文 件 也 是可以 接受的 ． 读 段 定 位 可 使 用bowtie2或者 TopHat等软件完成．
d. 计算平均读段密度和分析翻译效率、翻译差异． 一般排除读段数极少的转录本． 读段密度单位 一 般为 RPKM (reads per kilobase per millionmapped reads)． 翻译效率定义为核糖体足迹密度与mRNA 读段密度的比率．标准化法是将所有基因的翻译效率均除以所有基因的翻译效率的中位数. 翻译差异的计算，为对应的样本组之间的比值．标准化法同上，这样可以排除样本间总读段数差异的干扰．
2013.9.28
