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        中和反应技术

        互联网

        7200

        病毒或毒素与相应的抗体结合后,失去对易感动物的致病力,谓之中和试验。本试验主要用于:

        (1)从待检血清中检出抗体,或从病料中检出病毒,从而诊断病毒性传染病;

        (2)用抗毒素血清检查材料中的毒素或鉴定细菌的毒素类型;

        (3)测定抗病毒血清或抗毒素效价;

        (4)新分离病毒的鉴定和分型,中和试验不仅可在易感的实验动物体内进行,亦可在细胞培养上或鸡胚上进行。试验方法主要有简单定性试验、固定血清稀释病毒法、固定病毒稀释血清法、空斑减少法等。

        1、简单定性中和试验

        本法主要用于检出病料中的病毒,亦可进行初步鉴定或定型。先根据病毒易感性选定试验动物(或鸡胚、细胞培养)及接种途径。将病料研磨,并稀释成一定浓度(约100 LD50~1000LD50或TCID50)。污染的病料需加抗生素(青霉素、链霉素各200~1000单位),或用细菌滤器过滤,与已知的抗血清(适当稀释或不稀释)等量混合,并用正常血清加稀释病料作对照。混合后置37℃1h,分别接种实验动物,每组至少3只。分别隔离饲喂,观察发病和死亡情况。对照动物死亡,而中和组动物不死,即证实该病料中含有与该抗血清相应的病毒。本法亦可用于毒素(如肉毒毒素)的鉴定和分型。

        2、固定血清稀释病毒法

        本法多将病毒作10倍递增稀释,分置2列试管,第一列加正常血清(对照组),第二列加待检血清(试验组)。混合后,置37℃作用1h,将各管混合液分别接种选定的试验动物,每一稀释度用3~5只动物。接种后,逐日观察,并记录其死亡数,观察结束后,计算LD50和中和指数(表1、表2),本法适用于大量检样的检测。

        表1 固定血清稀释病毒法术式
        混合前病毒稀释2×10-12×10-22×10-32×10-42×10-52×10-62×10-7——
        正常血清稀释病毒——————1.01.01.01.0——
        正常血清——————1.01.01.01.01.0
        对照组稀释液——————————————1.0
        待测血清稀释病毒1.01.01.01.01.01.01.0——
        待检血清1.01.01.01.01.01.01.01.0
        中和组稀释液——————————————1.0
        混合后病毒稀释10-110-210-310-410-510-610-7——

        表2 固定血清稀释病毒法中和试验(例一)
        病毒稀释10-110-210-310-410-510-610-7LD50(2)中和指数
        正常血清对照组——————4/4(1)3/41/40/410-5.5103.3=1.995
        待检血清中和组4/42/41/40/40/40/40/410-2.2
        注:(1)分母为接种数,分子为死亡数;(2)LD50计算见实例。

        中和指数=中和组LD50/对照组LD50=10-2.2/10-5.5=103.3,查3.3反对数是1.995,故中和指数103.3=1.995。也就是说该待检血清中和病毒的能力为正常血清的1.995倍。本法多用以检出待检血清中的中和抗体,对病毒而言,通常中和指数大于50者判为阳性,10~49为可疑,小于10为阴性。

        3、固定病毒稀释血清法

        本法用以测定抗病毒血清的中和价,将待检血清2倍递增稀释,加等量已知毒价的病毒液(与血清混合后,每一接种剂量含病毒100LD50),摇匀后,置37℃作用1h,接种实验动物(表3)。

        表3 固定病毒稀释血清中和试验(例二)(1)
        血清稀释度(2)价(PD50)(4)1:1001:201:401:801:1601:3201:6401:12801:2560——血清中和

        正常血清

        0/4(3)————————————————————
        康复血清
        1:141
        4/44/44/43/42/40/40/40/40/40/4
        免疫血清
        1:1280
        4/44/44/44/44/44/44/42/40/40/4
        注:(1) 接种剂量0.1ml,含病毒100LD50;(2)系指与病毒混合后的稀释度;(3)分母为接种数,分子为保护数;(4)PD50为半数保护,其计算法同LD50的计算。

        4、空斑减少法

        在细胞培养上进行病毒中和试验,近年来多采用空斑减少法。先将病毒稀释成适当浓度,使每0.2ml含80个~100个PFU(空斑形成单位),与不同稀释度的待检血清等量混合,置37℃作用1h~2h,分别测定PFU,使空斑减少50%血清稀释度即为该血清的中和价。见表4。

        表4 空斑减少法中和试验示例
        血清稀释倍数(1)1:16
        (4-2)
        1:64
        (4-3)
        1:256
        (4-4)
        1:1024
        (4-5)
        1:4096
        (4-6)
        不加血清对照中和抗体价(2)
        待检血清A空斑数313385153554-3.6=1:140
        空斑减少率95%76%31%7%0%
        待检血清B空斑数——8525156554-4.1=1:290
        空斑减少率——85%54%7%0%
        待检血清C空斑数————62244554-5.2=1:1300
        空斑减少率————89%59%19%
        注:(1)血清用4倍递增稀释;(2)空斑减少50%的血清稀释度,其计算法同LD50的计算。

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