琼脂糖凝胶电泳技术

1、实验目的：

学习与掌握DNA电泳的技术方法，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度、含量以及分子量，及分离不同大小DNA片段。

2、实验原理：

电泳概念及种类

• 电泳： 是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象

电泳基本原理

迁移率（或泳动度）是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度，可用下列公式计算：

Ｕ =υ/E =(d/t)/(V/l) =dl/Vt

Ｕ为迁移率（cm2·V-1·min-1）；υ为颗粒泳动速度（cm·s-1）；E 为电场强度（ V·cm-1）；d 为颗粒泳动的距离（cm）；l为滤纸有效长度（cm）；V为实际电压（V）；t为通电时间（s或min）。通过测量d, l, V, t, 即可计算出被分离物质的迁移率。

1迁移率单位= 10-5 cm2·V-1·min-1 在确定的条件下，某物质的迁移率为常数，是该物质的化学特征常数

颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反之则泳动速度慢。

迁移率还与分子的形状，介质粘度，颗粒所带电荷有关，迁移率与颗表面电荷成正比，与介质粘度及颗粒半径成反比。

影响琼脂糖电泳迁移的主要因素：

电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度、电渗现象、温度的影响、支持物的影响、电泳的分类

按分离原理分类：

1.区带电泳

2.移界电泳

3.等速电泳

4.聚焦电泳

按有无固体支持物分类

影响琼脂糖电泳迁移的主要因素

DNA的大小

DNA的构象

琼脂糖浓度

缓冲液

不同构像质粒

分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度

缓冲液

TAE：乙酸盐缓冲液

TBE：硼酸盐缓冲液

TPE：磷酸盐缓冲液

实验操作

1. 用胶带将洗净、干燥的水平板的边缘封住，形成一个胶模并水平放置。

2. 按水平板的长×宽×0.5cm胶厚，量取0.5×TBE，并按0.7%的浓度称取agarose琼脂糖，在微波炉或电炉上加热至全熔_（清澈透明）。

3. 等凝胶温度降至大约50－60℃以下时，加入1 mg/L溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5ug/ml ；摇匀并轻快地倒入水平板中，除掉气泡，插入梳子。

4. 凝固后，将梳子轻轻拔出。

5.去掉胶带，将水平板放入加有0.5×TBE电泳缓冲液的电泳槽中，并且使电泳缓冲液高出凝胶约1mm。

6.在parafilm膜上依次加：

ddH2O 6μl

上样Buffer 2μl

DNA 4μl

分别混匀后点样，记录点样次序。

7. 在水平板两边的点样孔中分别加入6 μll的λΔΝΑ/EcoRI HindIII markeundefined。

8. 盖好电泳槽盖子，选择适当的电泳电压（≤5V/cm）及电泳方向(DNA阴极阳极），开始电泳。

9. 当色素接近胶的先端，停止电泳，样品在紫外灯下观察、成像。