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        核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶活性的测定

        互联网

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        核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase,RuBPCase)是光合作用碳代谢中的重要的调节酶,是植物中最丰富的蛋白质,主要存在于叶绿体的可溶部分,总量约占叶绿体可溶蛋白50%~60%。本实验用分光光度法测定酶的羧化能力。

        一、原理:

        在RuBPCase的催化下,1分子的核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)与1分子的CO2结合,产生2分子的3-磷酸甘油酸(PGA),PGA可通过外加的3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用,产生甘油醛-3-磷酸,并使还原型辅酶I(NADH)氧化.因此,由辅酶I氧化的量就可计算RuBPCase的活性,由340nm吸光度的变化可计算还原型辅酶I氧化的量。为了使NADH的氧化与CO2的固定同步,从而需要加入磷酸肌酸(Cr~P)和磷酸肌酸激酶的ATP再生系统。ADP+Cr~P磷酸肌酸激酶ATP+Cr

        二、材料、仪器设备

        (一)材料:菠菜叶片、小麦及水稻叶片。

        (二)仪器设备:1. 紫外分光光度计;2. 冷冻离心机,3. 匀浆器;4. 移液管;5. 秒表。

        (三)试剂:

        1. 5mmol/LNADH;

        2. 25mmol/L RuBP;

        3. 0.2mol/L NaHCO3;

        4. RuBPCase提取介质:40mmol/L(pH7.6)Tris-HCl缓冲溶液,内含10mmol/L MgCl2、0.25mmol/L EDTA、5mmol/L 谷胱甘肽;

        5. 反应介质:100mmol/L Tris-HCl缓冲液,内含12mmol/L MgCl2和0.4mmol/L EDTA-Na2,pH7.8;

        6. 160u/ml 磷酸肌酸激酶溶液;

        7. 160u/ml 甘油醛-3-磷酸脱氢酶溶液;

        8. 50mmol/L ATP;

        9. 50mmol/L 磷酸肌酸;

        10. 160u/ml 磷酸甘油酸激酶溶液;

        11. 菠菜的RuBPCase提取液。

        三、实验步骤

        1. 酶粗提液的制备 取新鲜菠菜叶片10g,洗净擦干,放匀浆器中,加入10ml预冷的提取介质,高速匀浆30S,停30S,交替进行3次;匀浆经4层纱布过滤,滤液于20000×g 4℃下离心15min,弃沉淀;上清液即酶粗提液,置0℃保存备用。

        2. RuBPCase活力测定按下表配制酶反应体系

        3. 反应介质

        4. 将配制好的反应体系摇匀,倒入比色杯内,以蒸馏水为空白,在紫外分光光度计上340nm处反应体系的吸光度作为零点值。将0.1mlRuBP加于比色杯内,并马上计时,每隔30S测一次吸光度,共测3min。以零点到第1min内吸光度下降的绝对值计算酶活力。由于酶提取液中可能存在PGA,会使酶活力测定产生误差,因此除上述测定外还需做一个不加RuBP的对照。对照的反应体系与上述酶反应体系完全相同,不同之处只是把酶提取液放在最后加,加后马上测定此反应体系在340nm处的吸光度,并记录前1min内吸光度的变化量,计算酶活力时应减去这一变化量。

        四、结果计算

        RuBPCase的酶活力(μmol/ml酶液/min)=ΔA×N×10/(6.22×2dΔt)

        式中:ΔA-反应最初1min内340nm处吸光度变化的绝对值(减去对照液最初1min的变化量);酶活力为每min每ml酶液固定CO2μmol数; N-稀释倍数 6.22-每μmolNADH在340nm处的吸光系数; 2-表示每固定1molCO2有2molNADH被氧化; Δt-测定时间为1min d-比色光程(cm)。

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