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        Western-Blot试剂配制

        互联网

        20488

        (一)母液


        1. 1.0mol/L Tris·HCl
        Tris (MW121.14) 30.29g
        蒸馏水 200ml
        溶解后,用浓盐酸调pH至所需点(见下所示),最后用蒸馏水定容至250ml,高温灭菌后室温下保存。
        PH HCl
        7.4 约17ml
        7.5 约16m
        7.6 约15ml

        8.0 约10ml


        2. 1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF
        PMSF 0.174g
        异丙醇 100ml

        溶解后,分装于1.5ml离心管中,-20℃保存。


        3. 0.2mol/L NaH 2 PO 3
        NaH 2 PO 4 (MW119.98) 12g
        蒸馏水至 500ml

        溶解后,高压灭菌,室温保存。


        4. 0.2mol/LNa 2 HPO 3
        Na 2 HPO·12H2O (MW 358.14) 71.6g
        蒸馏水至 1000ml

        溶解后,高压灭菌,室温保存。


        5. 10 %SDS
        SDS 10g
        蒸馏水至 100ml

        50℃ 水浴下溶解,室温保存。如在长期保存中出现沉淀,水浴溶化后,仍可使用。


        6. 10 %过硫酸胺(AP)
        过硫酸胺 0.1g
        超纯水 1.0ml

        溶解后,4℃保存,保存时间为1周。(可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中,一次性多装几管,使用时加入超纯水即可)


        7. 1.5mol/L Tris·HCl (pH8.8)
        Tris (MW121.14) 45.43g
        超纯水 200ml

        溶解后,用浓盐酸调pH至8.8,最后用超纯水定容至250ml,室温下保存。


        8. 0.5mol/L Tris·HCl (pH6.8)
        Tris (MW121.14) 15.14g
        超纯水 200ml

        溶解后,用浓盐酸调pH至6.8,最后用超纯水定容至250ml,室温下保存。


        9. 30 %(w/v)丙烯酰胺溶液
        丙烯酰胺 29g
        甲叉双丙烯酰胺 1g

        加去离子水,定容至 100ml 调整溶液 pH 值不超过 7.0,置棕色瓶中贮存于室温


        10. 20 %Tween20
        Tween20 20ml
        蒸馏水至 100ml

        混匀后4℃保存。


        (二)使用液
        单去污剂裂解液(PMSF) :
        1mol/L Tris·HCl (pH8.0) 2.5ml
        NaCl 0.438g
        TritonX-100 0.5ml
        蒸馏水至 50ml

        混匀后4℃保存。使用时,加入PMSF至终浓度为100μg/ml(0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl)。


        一般实际用的比较多的其实是RIPA裂解配方 :
        50 mM Tris-HCl pH 7.4
        150 mM NaCl
        1 mM PMSF (用前加)
        1 mM EDTA
        1% Triton x-100
        1% 脱氧胆酸钠
        0.1% SDS
        0.01mol/L PBS ( pH 7.2-7.4)
        0.2 mol/L NaH 2 PO3 19ml
        0.2 mol/L NaHPO 3 81ml
        NaCl 17g
        蒸馏水至 2000ml
        (如果用TBST进行洗膜的话,其实PBS用得很少,大可不必自己配制,向试剂公司购买20×的PBS浓缩液即可,500ml的浓缩液不到50元,很方便)
        G250 考马斯亮蓝溶液 (蛋白定量专用)
        考马斯亮蓝G250 100mg
        95 %乙醇 50ml
        磷酸 100ml

        蒸馏水至 1000ml


        配制时,先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料,再加入磷酸和水,混匀后,用滤纸过滤,4℃保存。
        0.15 mol/L NaCl
        NaCl (MW58.44) 0.877g
        蒸馏水至 100 ml
        高温灭菌后,室温保存。
        100mg/ml 牛血清白蛋白(BSA)
        BSA 0.1g

        0.15 mol/L NaCl 1ml


        溶解后-20℃保存。制作蛋白标准曲线时,用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml,-20℃保存。
        还原型 5XSDS 上样缓冲液
        0.5 mol/L Tris·HCl (pH6.8) 2.5ml
        二硫叔糖醇(DTT,MW154.5) 0.39g
        SDS 0.5g
        溴酚蓝 0.025g

        甘油 2.5ml


        混匀后,分装于 1.5ml 离心管中,4℃保存。
        电泳液缓冲液
        Tris (MW121.14) 3.03g
        甘氨酸(MW75.07) 18.77g
        SDS 1g
        蒸馏水至 1000ml
        溶解后室温保存,次溶液可重复使用 3~5 次。
        (电泳液可以回收重复利用,一般将回收的电泳液加入垂直电泳槽的下半部分,上半部分最好使用新鲜的电泳缓冲液)

        (可以配制成 10×电泳缓冲液进行保存,稀释 10 倍使用)


        转移缓冲液
        半干
        24mmol/L Tris ( MW : 121.14 ) 1.4536 g
        192mmol/L 甘氨酸( MW : 75.07 ) 7.20672 g
        20 %甲醇 100 ml
        蒸馏水至 500ml
        浸渍(湿转)
        48mmol/L Tris 2.375g
        39mmol/L 甘氨酸 11.25g
        20 %甲醇 200ml
        0.0375 % SDS 0.375g
        蒸馏水至 1000 ml
        溶解后室温保存,次溶液可重复使用 3~5 次(次溶液最好保存在 4 度冰箱,最多使用 5 次左右,不然影响转移效率)。(先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris 和 SDS,然后再加入甲醇,最后补足液体。如果先加入甲醇,溶解甘氨酸、Tris 和 SDS 等比较困难)

        (可以配制成 2×转移缓冲液进行保存,稀释后使用)


        10X 丽春红染液
        丽春红 S 2g
        三氯乙酸 30g
        磺基水杨酸 30g
        蒸馏水至 100ml
        TBS 缓冲液
        1 mol/L Tris·HCl (pH7.5) 10ml
        NaCl 8.8g

        蒸馏水至 1000ml


        (可以配制成 10×TBS 缓冲液进行保存,稀释 10 倍使用)
        TBST 缓冲液
        20 %Tween20 1.65ml
        TBS 700ml
        混匀后即可使用,最好现用现配。
        封闭液
        脱脂奶粉(国产) 5g
        TBST 100ml

        最好现用现配。


        洗脱抗体缓冲液
        14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β- 巯基乙醇) 700 μl (通风厨里加)
        SDS 2g
        0.5mol/L Tris·HCl (pH6.8) 12.5ml
        超纯水至 100ml
        配制时,在通风厨内进行。4℃保存。可重复使用 1 次。 (可用可不用)
        显影液(5X)
        自来水(加热至 50℃) 375ml (以下药品加到温水中)
        米吐尔 1.55g
        亚硫酸钠(无水) 22.5g
        碳酸钠(无水) 33.75g
        溴化钾 20.95g
        补水至 500ml
        配制时,上述药品应逐一加入,待一种试剂溶解后,再加入后一种试剂。4℃保存。使用时
        用自来水稀释至 1 倍。

        (不需要自己配制,有钱的直接买柯达的显影液,上千;没钱的到专业的照相器材市场购买即可,很便宜,一包 5 毛钱左右)


        定影液
        自来水(50~60℃) 700ml (以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者)
        硫代硫酸钠 240g
        亚硫酸钠(无水) 15g
        冰乙酸 12.6ml
        硼酸 7.5g
        钾明矾 15g (水温冷至 30℃以下时再加入)
        加水定容至 1000ml,室温保存。
        (不需要自己配制,有钱的直接买柯达的定影液,上千;没钱的到专业的照相器材市场购买即可,很便宜,一包 5 毛钱左右)
        化学发光试剂
        分 A 和 B 两种试剂,有钱可以购买 Amersham、Pierce 或者 Santa Cruz 的, 没钱的话国产的也能凑合。

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