生物学入门：关于TRIzol 提取总RNA的介绍

TRIzol是广谱型中RNA提取试剂。广泛应用于植物材料、动物组织、细胞及各种微生物等样品中提取RNA.本试剂能够提取完整的RNA。加入氯仿离心后，溶液分为三层：上层无色水相、中间层和下层红色有机相，RNA分布在上层水相中，收集上清层后，经异丙醇沉淀便可以回收得到总 RNA。提取的总 RNA 完整性好，无蛋白和 DNA 污染，可用于各种分子生物学常规实验，如 RT-PCR、Real-timeRT-PCR、NorthernBlot、DotBlot、体外翻译等。

实验试剂：

TRIzol（德元国际Cat# LY6151）、无水乙醇、氯仿、异丙醇、75%酒精、液氮

实验用具：

高速离心机、研钵、移液器，离心管，一次性手套、口罩等

操作步骤：

1. 样品处理

1） 动物组织：取新鲜或-70℃冻存动物组织尽量剪碎，每30-50mg 组织加入1mlTRIzol（德元国际Cat# LY6151），匀浆仪进行匀浆处理。或在液氮中研磨后加入TRIzol1ml（德元国际Cat# LY6151）混匀。
2） 植物组织：取新鲜植物组织在液氮中充分研磨或将植物组织剪碎后直接在TRIzol（德元国际Cat# LY6151）中迅速研磨，每30-50mg 组织加入1mlTRIzol，混匀。
3） 单层培养细胞：吸去培养液，加入适量TRIzol（每10cm2面积1mlTRIzol），反复吹打使细胞裂解。如果TRIzol的量不足可能导致RNA中有DNA污染。
4） 细胞悬液：不洗涤细胞，直接离心收集细胞。每5×106－1×107动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加入1mlTRIzol（德元国际Cat# LY6151）。
可选步骤：当样品富含蛋白质，脂肪，多糖或是细胞外物质例如肌肉，脂肪组织和植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤。匀浆化后在2~8°C的条件下以12,000×g的离心力离心10分钟，移除匀浆中不溶解的物质，余下的沉淀中包含有细胞外膜，多糖，以及高分子量DNA，而RNA存在于上清中。对于脂肪组织的样品中，大量的脂肪漂在最上层也应该除掉。吸取上清备用。

2. 将匀浆样品反复吹打几次，在室温条件下静置5min，使蛋白核酸复合物完全分离。

3. 向以上溶液中加入氯仿，每使用1mlTRIzon加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2-3min。

4. 4℃ 12,000 rpm离心15分钟，此时样品分成三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA 主要在水相中，把水相（约600μl）转移到一个新的离心管（自备）中。

5. 在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置10分钟。

6. 4℃ 12,000rpm 离心10分钟，弃上清。

7. 加入75%乙醇（用无RNase的水配制）洗涤沉淀。每使用1mlTRIzol用1ml75%乙醇对沉淀进行洗涤一次。

8. 4℃ 12,000rpm离心3分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃RNA沉淀。

9. 室温放置3-5分钟，晾干。加入30-100μl无RNase的水，充分溶解RNA，得到的RNA保存在-70℃，防止降解。

注意：沉淀不要过分干燥，以免难于溶解。