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        细胞增殖检测:3H-TdR渗入法实例

        互联网

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        一、原理

        T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体,在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA),抗CD2、抗CD3McAb作为多克隆刺激剂可选择性地刺激T细胞增殖;而抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌体(SAC)、脂多糖(LPS,对小鼠有作用)则刺激B细胞发生增殖;美洲商陆(PWM)、肿瘤刺激剂PMA对T、B细胞的增殖均有刺激作用。

        最近发现,integrin家族中VLA组中某些受体与相应配体结合后也能活化T细胞。根据形态学或氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入率测定T细胞的增殖水平。

        二、仪器、材料及试剂

        1、Beckman LS-9800型液体闪烁计数仪,或Beckman LS 6500型液体闪烁计数仪。

        2、多头细胞收集仪。

        3、3H-TdR(比活性为2Mci~10Mci/mg分子)。3H-TdR工作液:将1Mci/ml溶液以生理盐水稀释成100μci/ml,于4℃保存备用。临用时再用培养液稀释成10μci/ml溶液。3H-TdR一般临用时稀释。

        4、闪烁液:PPO(2,5-二苯基恶唑)、POPOP(1,4-双-2-15-苯基恶唑苯)Sigma公司。ppo5.0g popop0.1~0.3g 加二甲苯或甲苯至1L;POPOP加入少量二甲苯在37℃水浴上溶解后,再加PPO,然后补足二甲苯。配好的闪烁液需要闭光。闪烁液配制和检测的样品有关:

        5、其他:5%三氯醋酸;3%冰醋酸;浓甲醛;30%H2O2液

        三、操作步骤

        1、分离淋巴细胞(可来自外周血,脾细胞等)

            ↓

        2、洗涤后用10%FCS RPMI1640调整合适的细胞数(2×106/ml)

            ↓

        3、加入96孔培养板中,2×105细胞/100μl/孔,每组设3孔

            ↓

        4、加入最适剂量PHA或Con A,100μl/孔,同时设不加PHA或Con A阴性对照,一般每孔最终体积为200μl(细胞终浓度1×105)

            ↓ 37℃、5% CO2孵育,66h(20h后加药处理)

        5、每孔加入0.5~1μci 3H-TdR(50μl)

            ↓ 继续培养6~12h

        6、培养结束后,离心吸去上清液,用200μl 冷PBS洗涤二次(2000r/min离心10min)用冷PBS可以终止反应

            ↓

        7、用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集仪收集样品,于"9999"型玻璃纤维滤纸(膜)上。抽洗至少2次。

            ↓

        8、取出滤膜,排列好,置于干燥箱中,60℃~80℃,30min烘干(75℃烤箱过夜)。对号剪下各个滤膜片,然后将滤膜放入装有5ml的闪烁液中(贴细胞的面朝上)。闪烁瓶暗处放置15min。

            ↓

        9、β液闪仪(Beckman LS-9800型液体闪烁计数仪)计数(测定放射性cpm值)。

            ↓

        10、计算结果

        ①增殖水平直接用每分的脉冲数cpm值表示,再按标本淋巴细胞计数结果,校正成每百万淋巴细胞的脉冲数(cpm/106淋巴细胞)。取各管测定数的平均值。

        ②也可用刺激指数(SI)表示试验结果

        Con A/PHA(或实验组)cpm-机器本底

        SI=───────────────────────────────

        阴性对照组(不加Con A/PHA)cpm-机器本底

        以SI表示结果时,一定要设置相同数量培养孔的对照(即不加Con A/PHA)。而以cpm绝对值表示(cpm/106淋巴细胞)则可以不用设对照管。因为对照的cpm与本底比较接近,不同样品之间的少许差别也不易确定其意义。

        四、注意事项

        1、采用手工裁剪大小合适的玻璃纤维膜(Wallac公司)。废液瓶和真空泵之间最好加一个缓冲瓶,不要直接将真空泵上的橡胶管连接到废液瓶上,以免万一含3H(氚)的废液进入橡胶管。

        2、3ml 5%三氯乙酸固定、5 ml无水乙醇脱水(脱水后滤膜明显变白)。闪烁液的容水量很低,所以在加入闪烁液之前必须烘干。但加入一定量的醇类(如无水乙醇),则可容纳少量的处理后所残留的水分,但也仍需烘至接近干燥的程度,否则将发生浑浊而无法测定。据报道,如果闪烁液中加入1/3的异辛基苯氧聚乙氧乙醇(TritonX-100),其容水量可达15%,消化溶解后的样品,不必烘干,即可添加闪烁液测定。

        3、PHA、ConA、LPS等在正式实验前均需摸索最适剂量或亚适剂量。厂家和批号不同丝裂原作用常有很大差别。根据实验需要,对不同种(人、小鼠、大鼠、兔、狗等)不同来源淋巴细胞(胸腺、脾脏、淋巴结、扁桃腺、外周血等)均应进行最适细胞浓度、培养时间和刺激物浓度的摸索。

        五、单位换算

        Curies 和 d . p . m 的换算:

        Curies 和 Becquerels的换算:

        1 Curie (Ci) =2.22×1012 d . p . m .

        1 milliCurie (mCi) =2.22×109 d . p . m .

        1 microCurie (m Ci) =2.22×106 d . p . m .

        1 nanoCurie (nCi) = 2.22×103 d . p . m .

        1 picoCurie (pCi) =2.22 d . p . m .

        1 Ci = 3.7×1010 Bq =37GBq (gigaBq)

        1 mCi = 3.7×10 7 Bq =37MBq (megaBq)

        1 m Ci = 3.7×10 4 Bq =37kBq (kiloBq)

        1 GBq =2.7×10 -4 Ci =27.027mCi(milliCi)

        1 MBq =2.7×10 -7 Ci =27.027m Ci(nanoCi)

        1 kBq =2.7×10-10 Ci =27.027nCi (nanoCi)

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