免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项
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一、免疫荧光的标本制作的基本程序同DAB显色的免疫组化，不同点如下：
1. 免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其它相同。
2. 免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3. 二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4. 免疫荧光在封片使用专用封片剂或甘油：0.01MPBS （1：1）。
5. 条件许可可以购买防淬灭的试剂加入封片剂中，标本可以保存更久。
6. 荧光抗体的孵育以及后续处理需要闭光。
7. 荧光抗体染色假阳性可能会多，需要设定阳性和阴性对照。
二、注意事项
1. 荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，会使荧光减弱。
2. 每次试验时，需设置以下三种对照：
（1） 阳性对照：阳性血清+荧光标记物
（2） 阴性对照：阴性血清+荧光标记物
（3） 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物
三、免疫荧光双标的经验之谈
1. 选取primary antibodies时要来源于两种不同的动物，用来源于rabbit和rat的抗体，secondary antibodies则是不同荧光信号标记的，用donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。
2. 我的做法是两种primary antibodies同时孵育，然后两种secondary antibodies同时孵育。抗体浓度、孵育时间要认真摸索，感觉primary antibodies 4度孵育过夜比较好，背景比较干净。
3. 我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是rabitt和rat的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
4. Block用的血清使secondary antibody来源动物的血清，我的是10%正常donkey血清。
5. 其余同一般操作。
