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        免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项

        互联网

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        一、免疫荧光的标本制作的基本程序同DAB显色的免疫组化,不同点如下:

        1. 免疫荧光不需要使用双氧水处理,封闭和一抗孵育与其它相同。

        2. 免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育,孵育时间根据抗体的工作浓度确定。

        3. 二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。

        4. 免疫荧光在封片使用专用封片剂或甘油:0.01MPBS (1:1)。

        5. 条件许可可以购买防淬灭的试剂加入封片剂中,标本可以保存更久。

        6. 荧光抗体的孵育以及后续处理需要闭光。

        7. 荧光抗体染色假阳性可能会多,需要设定阳性和阴性对照。

        二、注意事项

        1. 荧光染色后一般在1h内完成观察,或于4℃保存4h,时间过长,会使荧光减弱。

        2. 每次试验时,需设置以下三种对照:

        (1) 阳性对照:阳性血清+荧光标记物

        (2) 阴性对照:阴性血清+荧光标记物

        (3) 荧光标记物对照:PBS+荧光标记物

        三、免疫荧光双标的经验之谈

        1. 选取primary antibodies时要来源于两种不同的动物,用来源于rabbit和rat的抗体,secondary antibodies则是不同荧光信号标记的,用donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。

        2. 我的做法是两种primary antibodies同时孵育,然后两种secondary antibodies同时孵育。抗体浓度、孵育时间要认真摸索,感觉primary antibodies 4度孵育过夜比较好,背景比较干净。

        3. 我的阳性对照采用的是阳性组织切片,阴性对照则分别是rabitt和rat的IgG,荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。

        4. Block用的血清使secondary antibody来源动物的血清,我的是10%正常donkey血清。

        5. 其余同一般操作。

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