临床样品基因组DNA小量抽提标准操作规程(SOP)

目的：

1.从人或动物血液中抽提DNA 。

2.从体液，唾液，尿液中抽提DNA 。

3.从人体组织，切片和各种临床样品中抽提DNA 。

4.抽提出的DNA 可以用于PCR及相关诊断。

原理：

临床常常需要从各种生物组织或细胞中抽提基因组DNA ，用于病症的辅助性分析和诊断。样品根据试剂盒（SK1341试剂盒，上海生工）提供的方法进行处理，然后在特定的DCL Buffer中用Protenase K和去污剂裂解。用UNIQ-10柱吸附样品中基因组DNA 。UNIQ-10能选择性吸附DNA ，而不吸附蛋白质和其它非核酸类物质。经简单的洗涤步骤，样品DNA 可用Elution Buffer回收。抽提出的DNA 可以用于PCR及相关诊断。

样品准备：

1.血液：

① 血液收集：血液必须用ACD(0.48% Citric Acid，1.32% Sodium Citrate，1.47% Glucose)抗凝。6ml血液用1ml ACD抗凝。因为从用肝素抗凝血液中抽提的DNA 常有PCR抑制剂存在，不能用于PCR反应。血液4℃可以存放2周左右，-20℃可以放置1~2月。

② 由于红细胞和血小板不含细胞核，血液中的DNA 主要来源于白细胞和血液中的病毒等。通常从200µl血液中可获约2~4µg DNA 。如果需要较大量的DNA ，可以用500µl血液。处理方法如下：500µl血液中加入1ml无菌水，5,000转/分，离心2分钟去上清。用200µl TE将白细胞悬浮起来备用。

③ 新鲜血样品如不能立即用于抽提DNA ，可置于4℃，但不要超过2个星期。欲长期储存，请分装成200µl/管，储存于-20℃。

2.血清

最好使用新鲜血清样品，否则样品应分装成200μl/管，-20℃保存。

3.生物组织：

① 5~30mg组织样品用手术刀切成小块，在液氮中碾碎。

② 将粉末收集到1.5-ml离心管中，用200µl TE悬浮。

4.石蜡生物组织：

① 25~30mg石蜡生物组织样品用手术刀切成小块，转入2-ml离心管（用户自备）中。

② 加入1.2ml二甲苯溶剂（用户自备）。用振荡器振荡。（目的是除去石蜡）

③ 用台式高速离心机，12,000转/分，室温离心5分钟。

④ 小心移走上清，注意不要移走沉淀物质。

⑤ 加入1.2ml无水乙醇，小心用振荡器振荡，室温放置1分钟。

⑥ 室温，12,000转/分，离心5分钟。

⑦ 重复步骤④~⑥一次以除去残留的二甲苯溶剂。

⑧ 打开离心管盖，小心弃上清，37℃保温10~15分钟以除去残留的乙醇。

⑨ 样品用200μl TE 悬浮。

5.生物体液：

① 将体液转移到离心管中，根据体液的性质，确定体液的用量。如果体液的体积小于200μl，可以直接使用。

② 5,000 转/分，室温离心10分钟。

③ 小心移走上清，沉淀用200μl TE悬浮。

6.尿液：

① 将尿液转移到离心管中，5,000 转/分，室温离心10分钟。

② 小心移走上清，沉淀用200μl TE悬浮。

7.眼、鼻、喉等拭样(Swabs)

① 将拭样(Swabs)转移到离心管中，加入2ml PBS(或生理盐水，用户自备)，室温浸泡2~5小时。

②　5,000转/分，室温离心10分钟。

③　小心移走上清，沉淀用200μl TE悬浮。

8.福尔马林处理的样品：

①　将25~30mg福尔马林处理样品用手术刀切成小块，转入离心管（用户自备）中。

②　加入2ml PBS(或生理盐水)，室温浸泡30分钟。

③　5,000 转/分，室温离心10分钟。

④　小心移走上清，重复步骤②-③一次。

⑤　小心移走上清，沉淀用200μl TE悬浮。

注意：

①　如果样品的体积不足200μl，加入TE补足到200μl。

②　如果样品不能马上用于抽提DNA ，可于-20℃保存备用。

③　样品不能反复冻融，否则DNA 的完整性（长度）和产率都会受到影响。

④　样品不要太多，否则DNA 的纯度和产率反而下降。

操作步骤:

1．在按样品准备方法制备的200μl样品中，加入400μl DCL Buffer，混匀; 加入3μl Proteinase K，混匀，55℃保温5~10分钟。

注意：① 应按次序加入，不得将Proteinase K先混入DCL Buffer，再加到样品中。② 保温时间取决于样品的类型。对于细胞样品，55℃保温5分钟足以使细胞裂解，释放出DNA 。而对于组织类样品，55℃保温则视降解效果而定。降解完全的样品应是透明不粘稠的液体。组织类样品一般在1-3小时内作用完全。过夜处理通常不影响产率。

2．加入260μl 无水乙醇，混匀，然后用1-ml Tip头将样品全部转移到UNIQ-10柱，柱子放入2.0-ml Collection Tube。

3．用台式离心机，10,000转/分，室温离心1分钟。

4.　取下UNIQ-10柱，弃去Collection Tube中的废液。将柱子放回同一根Collection Tube中，加入500μl Wash Solution，10,000转/分，室温离心1分钟。

5．重复步骤4一次。

6．取下UNIQ-10柱，弃去Collection Tube中的全部废液。将柱子放回同一根Collection Tube中，10,000转/分，室温离心1分钟，以除去残留的Wash Solution。

7．将柱子放入新的无菌的1.5 ml离心管中，在柱子中央加入50μl Elution Buffer，室温放置２分钟。

8．10,000转/分，室温离心1分钟。离心管中的液体即为DNA 。根据用途，样品可于4℃或-20℃保存。

注意：① 为提高洗脱效率，可以将柱子在37-55℃保温２分钟。② 如果样品中DNA 含量很低，用30μl Elution Buffer洗脱可以提高洗脱液的样品浓度。但是，产率有所下降。③ 重复步骤7-8，可以提高产率20%。

9．用分光光度计按1OD₂₆₀=50µg测量DNA 含量，并通过0.7%琼脂糖电泳凝胶判定DNA 的完整性，也可以判定样品中是否有RNA 。该试剂盒抽提出来的DNA 长度可在50kb以上。

注意：

① 血液样品中的DNA 产量取决于血细胞的数量。

② 从琼脂糖凝胶仅能观察到白细胞DNA ，血清中病毒DNA 因含量太少，不能用琼脂糖凝胶直接观察。③ 通常50μl PCR反应体系中用1-5μl DNA 抽提液。

主要参考文献：参阅Sangon提供的试剂盒操作手册。