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        原代胚胎成纤维细胞培养

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        一、实验器材:

        手术小直剪刀三把、眼科直镊子三把、眼科弯镊子两把、玻璃平 皿三套、200目尼龙滤网、50ML、15ML离心管和手术刀片。以上物品均需要高压灭菌消毒处理。

        二、实验试剂:

        无Ca+2和Mg+2的PBS、0.05%胰酶0.53mmol/L EDTA溶液、小鼠胚成纤维细胞(MEF)生长培养基:高糖DMEM加10%FCS。

        三、实验动物:

        孕期14至16天的孕鼠

        四、实验步骤:

        1、处死孕鼠,置于75%酒精里全身浸泡,然后在超净台中用一把剪刀和一把镊子把孕鼠外皮剪开,用另外一把剪刀和一把镊子把内皮剪开,露出子宫,最后用第三把剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有PBS的玻璃平皿中,冲洗去血。

        2、用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除,然后夹掉头和内脏,将其余胚胎转移到一个装有30MLPBS的50ML离心管中,轻轻颠倒两次,倒掉PBS,再重复此步骤一次,留少许PBS将胚胎转移到另一装有PBS的平皿中,用手术刀片将其细细切碎。

        3、用200ul的移液枪反复快速吹打平皿中的液体,放在15ML离心管中,4℃1500rpm离心5分钟,倒掉上清,加10ML胰酶,重悬沉淀,放37℃水浴中消化30分钟,且每隔五分钟轻轻晃动,使之充分消化。

        4、将上层细胞悬液倒入一装有10MLMEF生长培养基的50ML离心管中,用200目尼龙滤网过滤后,1500rpm离心5分钟收集细胞。30ML MEF生长培养基洗涤两次(此步骤中作者试过用无血清的培养基洗涤,结果无差别)。

        5、细胞沉淀用15ML生长培养基悬起,细胞计数(八只14天胎鼠可获得2-3×107细胞)。

        6、3×106细胞悬浮于15ML MEF生长培养基中,接种到200ML的培养瓶中。

        7、24小时后更换新鲜的MEF生长培养基。

        8、细胞长满后,先用PBS冲洗,倒掉,加胰酶消化(此步时间不宜过长,作者一般不超过五分钟),按1:5传代。

        9、细胞再次长到覆盖率80-90%左右,将其消化后,常规冻存。(冻存液要现配)

        五、讨论:

        1、原代培养,一定要避免污染。

        2、MEF生存能力有限,如果不冻存,体外存活十代左右。

        3、冻存后复苏的细胞只能传代一次,因为这些细胞繁殖能力有限。

        4、消化细胞时间不要过长。

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