初谈载体构建：引物使用心得

打算先尝试大家都赞的原核表达系统（操作简单才是上策，反正偶不打算把残存的青春继续贡献在充满毒物的环境中了），以及目前广泛应用的大名鼎鼎的Novogen公司的pET系列。

经历了一次低级错误后，在实验时最可以信赖的范博士的帮助下，终于将引物定稿。感谢英骏公司总部在进行机器调试，才让我有机会改正两天前的错误，虽然不是我毕业用的实验。

设计表达载体用的引物与克隆基因用的引物是两种完全不同的思路，后者需要考虑很多引物自身的性质以及所用模板区域等等。而我们要讨论的引物只有3‘端十几个碱基要与模板完全结合，而且只能选择orf的两端，所以我们不需要primer5的查找功能。大体有所了解后，就要开始了。

1、选择一个合适的载体，并确定纯化用标签等功能结构放在目的蛋白的N端或C端。

通常以从综述等文献资料里了解目的蛋白的信息为依据，如果实在是难以判断，就凭感觉吧，据说换载体都是经常的事情，sigh。。。

2、考虑是否要引入proteinase切位点

如果真考虑得足够远到成功表达纯化后的那一天，就要考虑把多余的结构切除了，选择proteinase后面的限制性内切酶，越近越好。

3、内切酶不能识别目的基因序列

用dnastar里的mapdraw就可以，输入目的基因的orf，只有absent site里面的酶可以用。我的低级错误就是：竟然把这一步忘了!!!!!!!

4、尽量选择酶切反应条件一样的两种酶

这里包括反应buffer（如果实在不能美全，差别也别太大），还有温度，我是今天才发现有些酶的反应温度不是37，有点无知者的震惊。这一步也是为了简化操作，可以直接使用双酶切，虽然有人不赞成。至于真正操作时的条件，到时再说吧。

5、两种酶之间的距离不能太短

这个容易理解，距离太近就像失去了保护碱基，影响酶的识别。所以越长越好，切完后电泳还能检测出来，但至于最小数，我不知道，应该和保护碱基的原理一样吧，但愿，我都只能找到相差19位的了。

6、不可出现移码

选定了酶就要考虑最最重要的，千万不要在N端出现移码（自身起始翻译的除外），出现移码一定要补齐，为啥就不用我说了。补的时候应该随便吧，别搞个稀有密码子就行。

7、加入保护碱基

按照neb网站的信息来就行了。http://www.neb-china.com/cn/tech/re/cleavage_olig.htm

8、引物Tm问题

范博士说引物的Tm之于配对的部分有关，颇有道理，那就只能根据所选orf部分的长度来调节了。

9、3‘二级结构

大家都说二级结构在这里不重要了，因为通常都是从载体上扩。这是调基因遗留的习惯，5’就不再费心去考虑它了，但是3'还是觉得利用orf部分的长度来稍微调节一下的比较放心。sigh，实验型强迫症。

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