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        PCR基因扩增技术

        互联网

        3630

        [实验目的]

        通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。

        [实验原理]

        多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物,经变性、退火和延伸若干个循环后,DNA扩增2n倍。

        1. 变性:加热 使模板DNA在高温下(94 ℃)变性,双链间的氢断裂而形成两条单链,即变性阶段。

        2. 退火:使溶液温度降至50-60 ℃,模板DNA与引物按碱基配对原则互补结全,即退火阶段。

        3. 延伸:溶液反应温度升至72 ℃,耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板,在引物的引导下,利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP),按5’→3’方向复制出互补DNA,即引物的延伸阶段。

        上述3步为一个循环,即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲,每经过一个循环,样本中的DNA量应该增加一倍,新形成的链又可成为新一轮循环的模板,经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。

        典型的RCP反应体系由如下组分组成:DNA模板、反应缓冲、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。

        [实验仪器与设备]

        1. PCR基因扩增仪

        2. 琼脂糖凝胶电泳系统

        [实验材料]

        1. DNA模板

        2. 4种dNTP

        3. 引物1和引物2

        4. Taq酶

        5. 琼脂糖

        6. DNA Marker

        7. tip

        8. eppendorf管

        9. 微量移液器

        附试剂的配制:

        1. 10×PCR缓冲液

        500 mmol/L KCl
        100 mmol/L Tris·HCl(Ph8.3,室温)
        15 mmol/L MgCl2
        0.1% 明胶

        2. 4×dNTP

        10 mmol/L dATP
        10 mmol/L dCTP
        10 mmol/L dGTP
        10 mmol/L dTTP

        3. Taq酶 1 u/μL

        4. DNA模板 1 ng/μL

        5. 引物溶液浓度 10 pmol/μL

        [实验步骤]

        1. 在0.5 ml Eppendorf管内配制25 μL反应体系

        反应物 体积/μL
        ddH2O 11
        10×PCR缓冲液 2.5
        2.5 mmol/L dNTP 2.0
        25 mmol/L MgCl2 1.5
        引物1 1.0
        引物2 1.0
        模板DNA 5
        Taq酶 1
        混匀,加25 μL石蜡油.

        2. 按下述程序进行扩增

        ① 94 ℃预变性 5min
        ② 94 ℃变性 1min
        ③ 52 ℃退火 1min
        ④ 72 ℃延伸 1min
        ⑤ 重复步骤②-④35次
        ⑥ 72 ℃终延伸 10min

        3. 琼脂糖凝胶电泳分析RCR结果

        配制1.5%琼脂糖凝胶,取10 μL扩增产物电泳。保持电流40 mA.电泳结束后,用EB染色15min,紫外灯下观察结果。

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