肿瘤坏死因子（TNF-α）对耐药肿瘤细胞凋亡的诱导作用
互联网
4690
以小鼠腹水型肝癌细胞亚系Hca/16A<,3>-F为细胞株，建立小鼠皮下种植瘤模型，用依托泊苷Vp-16治疗，诱导该肿瘤细胞耐药，一周后建立耐药模型，再用重组人肿瘤坏死因子α衍生物K2Rh-TNFα-Dk2治疗，通过电镜下的形态学观察以及促凋亡基因bax和抑凋亡基因bcl-2的蛋白表达情况，来研究TNF-α能否诱导对Vp-16耐药的肿瘤细胞凋亡，为克服耐药寻找新的途径。
方法：
1，Hca/16A<,3>-F细胞复苏后取第二代腹水，离心后用生理热水调整肿瘤细胞浓度为1×10<6>/0.2ml，615小鼠右侧腋下皮下注射接种，每只0.2ml，接种后第5～7d出现肿瘤，待种植瘤长至6～10mm时，将小鼠随机分为4组：阴性对照组小鼠自然生长、阳性对照组Vp-16、单药组Rh-TNFα-Dk2和联合组Vp-16+Rh-TNFα-Dk2，每组20只，雌雄各半。
2，各组自接种第8d开始给药，均为瘤内注射。
3，Vp-16连用3d，Rh-TNFα-Dk2连用8d。,
4，联合组小鼠应用两种药物须间隔一周。
5，从治疗开始的前1d种瘤第7d，即用游标卡尺测量皮下种植瘤的最长径及与之垂直的最宽径，每隔1d测量并记录，计算瘤体直径均值。
6，接种第28d随机脱颈处死各组一半的小鼠，称取瘤重，计算质量抑瘤率。
7，取新鲜瘤组织，一部分用10﹪的甲醛固定，常规石蜡包埋，连续4μm切片，用于HE染色常规病理学检查和免疫组织化学染色，检测bcl-2和bax蛋白在肿瘤组织中的表达情况。
8，另一部份用戊二醛固定，常规制备透射电镜标本，超薄切片机切片，透射电镜下观察各组瘤细胞的凋亡情况的差异。
9，各组另一半小鼠在相同条件下喂养，观察各组小鼠生存期的长短。,
结果:
1，由于Vp-16和TNF-α的副作用，Vp-16组、FNF-α组及联合组均有不良事件发生。
2，各组荷瘤大小：
治疗前种瘤第7d：
各组之间瘤体直径均值比较均P>0.05，无统计学差异；种瘤第10d：
联合组和阴性对照组比较P<0.05，有统计学差异，和Vp-16组、TNF-α组比较P>0.05，没有统计学差异；种瘤第16d及22d：
联合组和阴性对照组、TNF-α组比较P<0.01、P<0.05，有统计学差异，和Vp-16组比较P>0.05，没有统计学差异；种瘤第28d：
联合组和阴性对照组、TNF-α组比较均P<0.01，有统计学差异，和Vp-16组比较P>0.05，没有统计学差异；种瘤第34d：
联合组和阴性对照组、TNF-α组比较均P<0.01，和Vp-16组比较P<0.05，差异显著，有统计学意义。
3，第28d处死小鼠时的瘤重及抑瘤率：
在第28d，各组之间瘤重比较均P<0.01，差异显著，有统计学意义。
Vp-16组、TNF-α组、联合组的抑瘤率分别为48.97﹪、24.20﹪、72.49﹪。
可以看出联合组在控制瘤重方面优势最为明显，其次为Vp-16组和TNF-α组。
4，生存期比较：
联合组和阴性对照组、Vp-16组、TNF-α组比较，P<0.01，差异显著，具有统计学意义。
Vp-16组、TNF-α组、联合组的延命率分别为26.34﹪、22.76﹪、53.20﹪。
可以看出联合组在延长生存期方面优势最为明显，其次为Vp-16组和TNF-α组。
5，HE染色光镜结果：
联合组肿瘤细胞呈片状、条带状坏死，肿瘤组织细胞核碎裂、溶解，部分坏死组织呈均质红染无结构区域，其坏死灶明显多于Vp-16组、TNF-α组及阴性对照组。
经统计学分析，各组之间肿瘤内坏死组织面积百分比比较，均P<0.05差异显著，具有统计学意义。
6，电镜结果：
联合组凋亡细胞很多，很重，很典型，并且展示了凋亡过程的不同阶段。
而Vp-16组和TNF-α组镜下所见，凋亡细胞不是很多，不典型。
阴性对照组自发凋亡的细胞更少。
7，免疫组织化学染色分析：
bcl-2蛋白的表达情况：
bcl-2蛋白的表达量最多为阴性对照组，依次为Vp-16组、联合组、TNF-α组。
除TNF-α、联合组之间比较P>0.05，差异没有统计学意义之外，其他各组之间比较P<0.05或P<0.01，差异显著，具有统计学意义。
bax蛋白的表达情况：
bax蛋白的表达量最多为联合组，依次为TNF-α组、Vp-16组、阴性对照组。
除TNF-α、联合组之间，Vp-16组、TNF-α组之间比较P>0.05，差异没有统计学意义之外，其他各组之间比较均P<0.01，差异显著，具有统计学意义。
结论:
1．联合组在抑制肿瘤增殖方面具有明显优势。
2．联合组能显著延长荷瘤小鼠的生存期。
3．Rh-TNFα-Dk2对耐Vp-16的肝癌种植瘤除了直接的杀伤作用外，还能诱导肿瘤细胞凋亡，可能的机制为上调促凋亡基因bax的表达并下调抑凋亡基因bcl-2的表达
