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        实验30 叶绿体色素的分离(柱层析法)

        互联网

        12639

        叶绿体色素的分离(柱层析法)

        原理

          吸附剂如蔗糖、Al2 O3 、MgO、CaCO3 等对各种物质有不同的吸附力,吸附力的大小随吸附剂的种类而异;同一吸附剂在不同的溶剂中吸附力的大小也不同。被吸附的物质由于其结构中极性基团的种类和数量不同,吸附力也不相同。

        各种官能团的极性大小次序为;-CH2 -CH2 -<-CH=CH<-CH=CH-CH=CH-<-OCH3 <-COOR-<-C=O<-CHO<-SH<-NH2 <-OH<-COOH。

          本实验是把蔗糖粉末填入玻璃管中(压成柱状)作为吸附剂,将叶绿体的石油醚提取液倾于吸附柱上,色素即被吸附。

        由于色素的种类不同,被吸附的强弱不同,就在吸附柱上排列成为不同的色层,再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力,用不同的溶剂进行洗脱,从而达到叶绿体主要的4种色素(叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素)的分离。

        仪器药品

          铜筛      真空泵

          过滤瓶     分液漏斗

          研钵      量筒

          具塞三角烧瓶  小漏斗

          螺旋夹     乳胶管

          层析柱(直径1梍1.5cm,长约15梍20cm)_

          石油醚     丙酮

          无色汽油    苯

          乙醚      碳酸钙

          氯化钠

          蔗糖:将蔗糖磨细,过筛(筛孔0.10mm),为增强吸附力,使用前需在70─75℃下烘2小时。

        操作步骤

          1.色素的提取

          称取绿色组织2g,弃去粗大叶脉后剪成碎块,放在干净的研钵内,加入少量碳酸钙和石英砂,以及少量丙酮(干材料用85%丙酮,新鲜材料用无水丙酮),研磨成匀浆。减压过滤,滤液收集于量筒中,残渣再用丙酮洗涤数次,直至无色,定容20ml。提取液经反射光照射应观察到血红色荧光。

          丙酮提取液中不仅有叶绿体的色素,而且也有能溶于丙酮中的化合物,为了更好地分离色素,必须用石油醚纯化色素。

          纯化色素时将丙酮提取液转入分液漏斗中,加等量石油醚,轻轻摇动,再加等量饱和NaCl溶液振摇,再加等量蒸馏水振摇,放置分层。待明显分为两层,上层为深绿色石油醚层,有显著的荧光性。小心地把下面的丙酮水液层放掉,用洗瓶沿漏斗壁以水洗涤石油醚层6─7次,以彻底洗去丙酮。定容为20ml,所得石油醚色素提取液置于棕色瓶中待用。

          2.吸附柱的制备

          (1) 干法装柱

          把层析柱的玻管部分固定在抽滤瓶上,在玻管的基部用清洁的脱脂棉填上,使松紧合适,于其上放一大小合适的圆形滤纸片,柱的上端放一小漏斗,取烘过的蔗糖粉由小漏斗装入柱中,边装边轻敲柱外壁,随后进行抽气,使蔗糖柱紧实,约为15cm长。

        装好吸附剂后于其上轻轻盖上一片大小合适的圆形滤纸,小心地注入石油醚,抽滤,当蔗糖柱全部被石油醚浸湿,且在柱上面留有少量石油醚时,停止抽吸。

          (2) 湿法装柱

          层析柱用夹子垂直固定于铁架上,下端套上一段乳胶管,在乳管的另一端套上一玻璃管,在乳胶管上夹一螺旋夹,以控制流速。柱子下端同样填上脱脂棉,放上小滤纸片,柱上放一小漏斗。先关闭螺旋夹,注入一定体积的石油醚于柱中,打开螺旋夹,让石油醚以每秒1滴的流速流下,当注入的石油醚流至柱的3/4处,从小漏斗缓缓装入蔗糖粉,抽吸,并在蔗糖柱上盖一滤纸片,待石油醚快流完时,停止抽吸。

          3.色素的分离

          将色素提取液2ml倾入吸附柱上,当色素提取液将要全部进入蔗糖柱中,加入一定体积的石油醚冲洗,抽吸,至柱上的颜色快要扩展到吸附柱的下端时,就在柱上出现不同颜色的色带,上面是黄绿色的叶绿素b,其次是蓝绿色的叶绿素a,再下面是黄色的叶黄素,胡萝卜素没有被蔗糖吸附,出现在柱的最下端或随洗脱剂石油醚进入抽滤瓶中。

          4.色素的洗脱

          分布在柱上各色带的位置彼此很接近,为了更好地分离,需将各色带分开有较大的距离。

        为此可加入10─15ml汽油—苯的混合液)(10∶1),抽滤,混合液渗入后,胡萝卜素从吸附柱上全部排出,叶黄素与叶绿素a分开,并逐渐被洗脱下来。这时再加入汽油—苯的混合液(1∶2),抽滤,叶绿a和叶绿素b更清楚地分开,叶绿素a被洗脱,叶绿素b可用乙醚(或乙醇)洗脱。

          注:为了更好地观察叶绿体的4种主要色素,可在柱子的最下端装入中性氧化铝,约占柱长的1/5,上面再装蔗糖,制成吸附剂的混合柱,这样从上到下为叶绿素b,叶绿素a,叶黄素和胡罗卜素,4种色素会很好地分离。

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