SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量

一、目的

了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，并学会用这种方法测定蛋白质的相对分子量。

二、原理

聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。

SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物。

其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）可以用圆盘电泳，也可以用垂直平板电泳，本实验用目前常用的垂直平板电泳，样品的起点一致，便于比较。

三、 试剂和器材

（一） 试剂

1、凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr）29.2g，亚甲基双丙烯酰胺（Bis）0.8g，加重蒸水至100ml.外包锡纸，4℃冰箱保存，30天以内使用。

2、分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8。

18.15 Tris（三羟甲基氨基甲烷），加约80ml重蒸水，用1mol/LHCl调pH到8.8，用重蒸水稀释至最终体积为100ml，4℃冰箱保存。

3、 浓缩胶缓冲液：0.5mol/LHCl，pH6.8。

6gTris,加约60ml重蒸水，用1mol/LHCl调pH至6.8，用重蒸水稀释至最终体积为100ml，4℃冰箱保存。

4、 10%SDS，室温保存。

5、 两类样品缓冲液：

（1）2倍还原缓冲液（2×reducing buffer）。

0.5mol/L HCl，pH6.82.5 ml

甘油2.0 ml

质量浓度10%SDS4.0ml

质量浓度0.1%溴酚蓝0.5ml

β-巯基乙醇1.0 ml

总体积10 ml

（2）2倍非还原缓冲液（2×non-reducing buffer）。

重蒸水1.0 ml

0.5mol/L HCl，pH6.82.5 ml

甘油2.0 ml

质量浓度10%SDS4.0ml

质量浓度0.1%溴酚蓝0.5ml

总体积10 ml

6、电极缓冲液，pH8.3。

Tris3g，甘氨酸14.4g，SDS1.0g加重蒸水1000ml，4℃冰箱保存。

7、低相对分子质量标准蛋白质（上海产），开封后溶于200μl重蒸水，加200μl2倍样品缓冲液（还原缓冲液），分装20小官，-20℃保存。临用前沸水浴3～5min其相对分子质量（Mr）如下：标准蛋白质Mr

兔磷酸化酶B97 400

牛血清白蛋白66 200

兔肌动蛋白43 000

牛碳酸酐酶31 000

胰蛋白酶抑制剂20 100

鸡蛋清溶菌酶14 400

8、质量浓度为10%过硫酸铵：此溶液需临用前配制。

9、染色液：0.25g考马斯亮蓝R250，加入91ml50%甲醇，9ml冰醋酸。

10、脱色液：50ml甲醇，75ml冰醋酸与875 ml重蒸水混合。

11、待测相对分子质量的样品。