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        考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量

        互联网

        9353

        考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量

        [原理]

        考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度,是利用蛋白质-染料结合的原理,定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。

        考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式,红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色,最大光吸收在465nm,当它与蛋白质结合后变为蓝色,最大光吸收在595nm。

        在一定的蛋白质浓度范围内,蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比,通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

        蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合,在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速,其结合物在室温下1小时内保持稳定。蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数,使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高,可测微克级蛋白质含量。

        [方法与步骤]

        1、标准曲线绘制

        取6支试管,按下表加入各 试剂 。

        管号

        试剂

        0

        1

        2

        3

        4

        5

        100μg/ml牛血清白蛋白溶液/mL

        0

        0.2

        0.4

        0.6

        0.8

        1.0

        蒸馏水/mL

        1.0

        0.8

        0.6

        0.4

        0.2

        0

        考马斯亮蓝液/mL

        5.0

        5.0

        5.0

        5.0

        5.0

        5.0

        加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后,摇匀,放置2min后,在595nm波长下比色测定,记录A 595 。

        以各管相应标准蛋白质含量(mg)为横坐标、A 595 为纵坐标,绘制标准曲线。

        2、样品测定

        试管 中加自制蛋白质样品1.0mL ,再加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂,摇匀,放置5min后,在595nm波长下比色,记录A 595 。

        根据所测A 595 从标准曲线上查得蛋白质含量。

        注意事项

        (1) 如果测定要求很严格,可以在试剂加入后的5~20min内测定光吸收,因为在这段时间内颜色是最稳定的。比色反应需在1h内完成。

        (2) 测定中,蛋白-染料复合物会有少部分吸附于 比色杯 壁上,实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的 比色杯 洗干净。

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