氰化高铁血红蛋白测定法及红细胞计数的方法与注意事项

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本实验的主要目的是掌握氰化高铁血红蛋白测定法原理、方法与操作步骤；掌握血细胞计数板的使用和结构；了解红细胞计数的原理、方法与步骤。具体实验方法如下：

实验目的要求：

通过血红蛋白测定、红细胞计数实验要求：

1、掌握红细胞计数、血红蛋白测定的原理、方法及注意事项。

2、掌握血细胞计数板的结构

一、血红蛋白测定(Hemoglobin简称Hb)

(氰化高铁血红蛋白法)

【原理】

血红蛋白中的亚铁离子(Fe2+)被高铁氰化钾氧化成高离子(Fe3+)，血红蛋白转化成高铁血红蛋白，高铁血红蛋白与氰离子(CN-)结合，生成稳定的氰化高铁血红蛋白。用光电比色计在540nm波长比色。从HicN参考液制作的标准曲线上读取血红蛋白克数。

【操作】

取试剂5毫升加入血液20ul混匀置5分钟后用721光电比色仪，540nm波长，试剂为空白调0点比色，读取光密度，查标准曲线得结果。

二、红细胞计数(red blood Cell 简称RBC)——显微镜直接计数(试管法)

【原理】

一定量的血液经一定量等渗性稀释液稀释后，充入血细胞计数池中显微镜下计数一定容积内的细胞，再换算成每升标本的细胞数报告。

【操作方法】

l、取红细胞稀释液2.0ml毫升，放入一小试管内。

2、用血红蛋白吸管吸血至l0ul处。

3、擦去管尖外部余血将血液迅速轻轻吹入盛有红细胞稀释液的试管内，吸上清液嗽洗吸管2-3次，立即摇匀。

4、用玻棒取混悬液少量，充入计数池内。

5、待2—3分钟，让红细胞完全下沉后，将计数板平放在显微镜台上，用低倍镜观察，如红细胞分布均匀即可换高倍镜进行计数。

红细胞计数的区域:

中心大方格中的5个中方格(正中一个和四角各一个)。

计数原则:

数上不数下，数左不数右的计数原则即凡压在中方格边线(双线)上的红细胞，只计上侧与左侧线上的细胞，而压在下侧与右侧线上者不计入。

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注意事项：

1、吸管、试管要注意清洁、干燥以防溶血，操作迅速避免血液凝固，如有血凝块应重新采血。

同时做血红蛋白测定，白细胞计数和分类计数，在采血时应先做血膜再做红细胞，然后做白细胞，血红蛋白检验，避免红细胞破坏。

2、充液：

充液前，红细胞复液要充分摇匀，红细胞悬液注入计数池内要求分布均匀，不可有气泡，亦不可有多余液体外溢。

3、质量控制：

中方格内红细胞分布应均匀，健康成人每中方格红细胞数约为80—100个，各中方格内之红细胞相近，如悬殊过大(超过10个细胞以上的)应重混匀再充填。

报告方式：

Hb ： g/L

RBC: ×l012/L

小结：在测定血红蛋白吸光值前，需要校准分光光度计 ，HicN参考液中KCN是剧毒物品，配制的时候一定要严格按照程序操作，避免溶液对自身的伤害。