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        RNA的电泳,转膜和杂交

        互联网

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        实验原理:

        基本同Southern Blotting,但因RNA是单链分子,必须消除局部区域形成的二级结构,在电场中泳动的距离才能反映它本身的大小,因而需使用变性胶进行电泳;操作过程中应特别注意防止RNA的降解。

        实验材料:

        经检测质量好的RNA样品。

        实验步骤:

        1.制胶:
          Agarose 1%-1.2%,1×MOPS buffer。
          用灭菌的DEPC水定容,加热融化,冷却至70℃加甲醛,使终浓度为2%,通风橱中放1hr。

        2.准备电泳液:1×MOPS buffer(小号槽约配500ml,中号槽约配900ml)。

        3.制样:测好浓度后按以下体系加样
          15 mg RNA + 灭菌的DEPC水  10 ml
          Sample buffer         8 ml
          loading buffer         2 ml
          EB (10mg/ml,专用于RNA)  0.03 ml
          65℃水浴变性10 min,立即放冰上,直至点样。

        4.点样:点样要仔细,不要漏出,并记录点样顺序。

        5.电泳:中号槽,电压100V电泳1hr左右,至溴酚兰离点样孔约3.5-4cm(凝胶在紫外灯下可看到28S和18S刚好分开即可)。

        6.转膜:转膜液用500ml 4×SSC加27ml 。
          37%甲醛(终浓度为2%);转膜步骤同Southern。注意加溶液后一切操作均在通风橱内进行,以避免甲醛对人体的伤害。

        7.照相:将胶及膜取下,分别在凝胶成像系统下看胶上RNA是否有残留,膜上RNA效果是否完好。

        8.风干:在超净工作台上吹干。

        9.固定:于紫外交联仪内以1200 ENERGY照一次约半分钟,再重复一次,再在超净工作台上吹干。

        10.杂交:在杂交管内加约50ml杂交液,将膜卷起放入,注意RNA面朝内,于64℃预杂交1-4hr 。


        11.探针准备:预先挖胶回收的PCR产物或酶切产物(better),测浓度,跑胶验证后,按以下体系加入。
          DNA         3 ml(约200ng)
          ddH2O        10 ml
          DNTP(1.67mM)   4 ml
          杂交Buffer      10 ml 
          Klenow Fragment   2 ml
          α-dCTundefined       5 ml
          先加入DNA 和 ddH2O,100℃变性10min,冰上放5min,再加入DNTP和杂交primer,加酶时注意低温操作,先加在管壁上,立即到同位素室加同位素,混匀离心,于室温下反应半小时。

        12.探针纯化:在原反应体系中继续加入
          ddH2O   66 ml
          NaAc    10 ml
          无水乙醇  250 ml
          混匀离心12000rpm  5min,倒去上清后加500 ml无水乙醇洗,离心2 min,12000rpm,倒去上清,检测信号,达103-104较好,加40 ml ddH2O和400 ml杂交液之后混匀离心,于100℃变性10min,冰上放置5min。

        13.探针:取出杂交管倒去杂交液,加入15ml杂交液,将探针加入,盖紧,于64℃杂交过夜。

        14.洗膜,压片:将杂交管中液体倒出,先加少量洗膜液Ⅰ,冷洗5min,倒出,再多加些洗膜液Ⅰ,冷洗10min,将膜取出测信号,根据信号大小决定是否热洗,若信号高,用洗膜液Ⅱ,Ⅲ继续洗,直到信号值达到适宜值为止,即膜上某一区域信号强,而其他区域信号弱代表杂交上了,然后包膜压片,放于-20℃或-80℃3天左右即可洗X片。

        15.结果观察与分析。

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