• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        从RNA中提取mRNA的方法

        互联网

        5843

        从总RNA中分离mRNA

        采用Promega公司的PolyATract® mRNA Isolation System III。

        使用该试剂盒,mRNA产量极低,因此下述方法是以Promega公司试剂盒操作手册为基础,并采用储昭晖硕士(作物遗传改良国家重点实验室植物分子生物学水稻分室)所建议的改进方法综合而成。

        由使用者自备的材料

        65℃水浴
          无菌的、无RNase的1.5ml塑料离心管
          f无菌的、无RNase的加样枪和枪头

        操作步骤

        1.探针的退火

        1)在一个无菌的、无RNase的离心管中,加入未稀释的总RNA溶液,使终体积达到1.5ml。可使用更大量的总RNA,其浓度可至过饱和,即有絮状RNA沉淀析出,但当有絮状RNA沉淀存在时,后续的退火反应操作会受到一定程度影响;也可使用更少量的总RNA(50ug),但mRNA产量可能无法保证。

        2)将离心管置于65℃水浴中10分钟或略长时间。

        3)加入15ul 的Biotinylated-Oligo(dT)探针和39ul的20×SSC到RNA中。颠倒数次以混匀,静置于室温下至充分冷却。这将需要10分钟或略少的时间。在该溶液冷却期间,制备0.5×和0.1×SSC贮存液

        2.贮存液制备

        1)通过在三个无菌的、无RNase的离心管中各自混合30ul的20×SSC和1.170ml的无RNase的水来制备三份1.2ml的无菌的0.5×SSC。

        2)通过在三个无菌的、无RNase的离心管中各自混合7ul的20×SSC和1.393ml的无RNase的水来制备三份1.4ml的无菌的0.1×SSC。

        3.链霉抗生物素蛋白-磁珠(Streptavidin-Paramagnetic Particles)的漂洗

        1)取三管链霉抗生物素蛋白-磁珠,轻弹离心管的底部使SA-PMPs重悬直至其充分分散,吸取悬液合并于一管。

        2)使汇总的SA-PMPs重悬直至其充分分散,然后将离心管置于磁柱中直至SA-PMPs已经聚集在离心管壁上(大约30秒)。小心地移出上清。不要离心沉淀颗粒。

        3)用0.5×SSC漂洗SA-PMPs三次(每次0.9ml),每次都使用磁柱来捕获它们,然后小心地移去上清。

        4)重悬漂洗过的SA-PMPs于0.3ml的0.5×SSC中。

        4.Oligo(dT)-mRNA退火杂合体的捕获和漂洗

        1)将退火反应的全部成分加入到含有漂洗过的SA-PMPs的离心管中。

        2)室温下静置10分钟。每1-2分钟轻柔地颠倒一次以混匀。

        3)用磁柱捕获SA-PMPs,小心移去上清,注意不要搅动SA-PMPs颗粒。当总RNA为过饱和高浓度时溶液时,退火反应易形成黑色絮状物,磁柱吸附也难以压缩其体积,这时应小心吸取上清;保留上清直至确信mRNA的结合与洗脱已是令人满意。

        4)用0.1×SSC(每次0.9ml)漂洗颗粒4次,其间轻弹离心管底部直至颗粒已被重悬。最后一次漂洗后,在不搅动SA-PMPs的前提下,以8000rpm离心1分钟,尽可能多地移出液相。


        5.mRNA的洗脱 

        1)为洗脱mRNA,将最终的SA-PMPs重悬于0.1ml的无RNase的水中,温柔地轻弹离心管以重悬颗粒。

        2)65℃水浴2分钟。

        3)用磁场捕获SA-PMPs,8000rpm离心30秒。

        4)将含有洗脱的mRNA的液相移入一无菌的、无RNase的离心管中。勿将颗粒丢弃。

        5)重悬SA-PMP颗粒于0.15ml的无RNase的水中,65℃水浴2分钟,用磁场捕获SA-PMPs,8000rpm离心2分钟。将洗脱液与5. 4)步骤中洗脱的mRNA合并。
        6)如果这时有任何颗粒也被携带到终溶液中,可用10,000×g,4℃,5-10分钟的离心来去除。小心地将RNA转入一新鲜的无RNase的离心管中。

        6.mRNA的浓缩

        1)加入等体积异丙醇,混匀。通常立刻有肉眼可见之沉淀生成,立即以12000rpm离心10分钟,沉淀mRNA。或根据沉淀生成的难易,-20℃放置数小时或过夜再沉淀。

        2)小心倒去异丙醇,加75%乙醇洗涤。

        3)小心倒去75%乙醇,室温干燥。

        4)将mRNA溶于20ul无RNase的水中。注意管壁上通常会粘附大量mRNA沉淀,用枪头吸取水滴在管壁上滚动数次以尽可能回收mRNA。

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序