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        小鼠肝基因组DNA制备

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        原理

        DNA 以核蛋白形式存在于细胞核中,制备 DNA 的原则是既要将 DNA 与蛋白质、脂类和糖类等分离,又要保持 DNA 分子的完整。蛋白酶K 及链霉蛋白酶 E 的应用使这两个原则得到了保证。

        蛋白酶K 或链霉蛋白酶 E 均为广谱蛋白酶,其重要特性是能在 SDS 和 EDTA 存在下保持很高的活性。

        在匀浆后提取 DNA 的反应体系中, SDS 可破坏细咆膜、核膜,并使组织蛋白与 DNA 分子分离, EDTA 抑制细胞中 DNase 活性,蛋白酶 K 或链霉蛋白酶 E 将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使 DNA 分子完整地分离出来。再用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质,接着用氯仿抽提以除去 DNA 溶液中微量酚的污染。

        最后用无水乙醇沉淀 DNA 。为获得高纯度 DNA ,操作过程中常加入 RNase 除去 RNA 。获得高分子量 DNA 的关键是防止 DNase 降解 DNA 。故标本必须新鲜,在提取前细胞就保持完整,核、溶酶体等细胞器应没有明显破坏,提取 DNA 用的离心管等器皿及试剂应消毒。操作在4 ℃以下进行。

        操作

        1 .组织 DNA 的提取

        1) 取小鼠新鲜肝组织,去除结缔组织,用剪刀剪成细小碎块

        2) 加 10 倍体积 TE 缓冲液,用玻璃匀浆器在冰浴中中速匀浆

        3) 将匀浆液转入 10ml 离心管以 4000rpm 离心 10 分钟,弃上清

        4) 加 10 倍体积 TE 洗一遍,以 4000rpm 离心 10 分钟,弃上清

        5) 加适量 TE 稀释

        6) 取 400µl 稀释液于 1.5ml 的 Eppendorf 管,缓慢加入 10 %SDS 溶液,至终浓度 0.5 % ( 加 20µ1) ,摇匀直至溶液变粘稠

        7) 加入 Rnase(200µg/m1) 至终浓度 20ug/m1(42µl) 混匀,置 37 ℃保温 60 分钟总体积 (420µ1) 。

        8) 加蛋白酶 K(20mg/m1) 至终浓度 100ug/m1 混匀 ( 加 21u1) ,于 50 ℃保温 3 小时,并间歇搅动 ( 总体积 441µ1) 。

        9) 将此溶液冷却至室温,加等体积饱和酚抽提,以 10000rpm 离心 10 分钟。

        10) 取上清加 1/2 体积饱和酚, 1/2 体积氯仿/异戊醇抽提一次,以 10000rpm 离心 10 分钟

        11) 取上清,加等体积氯仿/异戊醇抽提一次,以 10000rpm 离心 10 分钟

        12) 加 1/10 体积 5MKAc ,加 2 倍体积无水乙醇充分混匀,以 12000rpm 离心 10 分钟

        13) 加 lml70 %乙醇洗沉淀,以 12000rpm 离心 10 分钟

        14) 待酒精挥发尽后加 20ul TE 溶解, 4 ℃储存

        2 .电泳鉴定

        取 DNA 样品 2µ1 加上样缓冲液 10µ1 ( 含溴酚蓝指示剂和甘油 ) ,在 0.8 %琼脂糖凝胶进行水平微型电泳,电压 <5V/cm ,时间 2 小时左右。电泳后取出凝胶,用 0.5µg/ml 的溴化乙锭染色 20 分钟,用紫外灯观察分析。

        试剂及器材

        1 .试剂

        蛋白酶 K :称取 20mg 蛋白酶 K 溶于 lml 消毒双蒸水中,- 20 ℃备用。

        RNase( 牛胰 ) :称取 10mgRNase 溶于 lml 下列混合液中: 10mmol/l Tris-HCl , pH8.0 ; lmmol/L EDTANa2 pH8.0 ; 50 %甘油。

        10 %SDS 溶液:称取 10gSDS 溶于 100ml 消毒双蒸水中,于 65 ℃保温 2 小时,贮存室温备用。

        1 × TE 缓冲液 (pH8.0) : 10mmol/L Tris-HClpH8.0 ; lmmol/LEDTANa2 pH8.0 。配制后高压灭菌, 4 ℃贮存。

        1 × TE 饱和重蒸酚 (pH8.0)

        氯仿/异戊醇 (24:1V/V)

        10mol/LNH4 AC ,配制后高压灭菌, 4 ℃贮存

        无水乙醇 (AR)

        70 %乙醇

        2 .器材

        玻璃匀浆器;离心机;电泳仪;电泳槽;紫外透射反射分析仪。

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