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        滚动式循环放大法IHC增敏方法

        互联网

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        滚动式循环放大(RCA)法是一种能够在恒温条件下,使标记有寡核苷酸探针(与组织细胞内的核苷酸无相关性)的抗体(特异性一抗或第二抗)与组织细胞内的抗原结合后,在DNA聚合酶的作用下,加入的寡核苷酸进行循环扩增,产生一条扩增的DNA序列拷贝产物。

        此时,标记在抗体上的寡核苷酸得到有效扩增(109倍),扩增后的产物与后续加入的标记有示踪物的寡核苷酸进行互补杂交,在抗原-抗体周围形成众多带有标记示踪物的杂交体,最后通过IHC方法再放大示踪物。

        该方法具有很高的敏感性和特异性。首先要合成三条寡核苷酸探针(引物),然后将寡核苷酸与抗体结合,最后进行RCA免疫组化染色。

        左上为寡核苷酸标记的特异性抗体与组织细胞内的特异性抗原结合;右上为DNA聚合酶作用下与放大抗体分子上结合的核苷酸;左下为用标记示踪剂的寡核苷酸进行互补杂交;右下为用IHC方法进一步放大检测

        (一)寡核苷酸的合成与抗体连接寡核苷酸

        L标记抗体用寡核苷酸

        5,-AAAAAAAAAAAAAAAAATGATCACAGCTGAGGATAGGACATGCGA-3,

        2. 循环放大寡核苷酸

        5,-PCGCATGTCCTATCCTCAGCTGACAGAACTCACCTGTTAGACGCCACCAGCTCCAACTGTAAGATCGCTTAT-3,

        3. 带有标记物的互补检测用寡核甘酸

        5,-XACTGTGAAGATCGCTTATX-3,(X=生物素),或用5,-FACTCTGAAGATCGCTTATF-3,(F=荧光素);或用5,-HRPACTGTGAAGATCGCTTAT HRP-3,(HRP=辣根过氧化物酶)。

        (二)寡核苷酸与抗体的结合

        连接用的抗体可以是特异性一抗,也可以是第二抗体或其他的连接二抗,如抗地高辛(Dig)、抗荧光素(FITC)或抗生物素(biotin)二抗。

        1. 抗体的脱盐和活化

        首先对抗体免疫球蛋白进行脱盐,然后进行抗体活化。在41 nmol抗体分子中加入410mmol的GMBS[硫代-N-(4-马来酰亚胺丁酰)硫代丁二酰亚胺,sulfo-N-(4-maleim-idobutyryloxy)sulfosuccinimide],暗处,37℃,在氮气中30 rain,移人室温中继续反应30min,用PD-10色谱柱(用pH7.5 PBS平衡柱子)除去多余的磺化-GMBS,将活化抗体4℃浓缩。此时每一个抗体分子中含有多个马来酰亚胺,可以用Ellman's试剂滴定活化抗体的量,主要测定抗体分子上的巯基。抗体活化后与寡核苷酸连接。

        2. 活化抗体与寡核苷酸结合

        将28.1nmol磺化GMBS活化抗体和142 nmol5硫醇寡核苷酸混合,总体积为825ul,室温中反应2h,随后移人4℃中反应过夜。

        3. 纯化结合物

        纯化结合物一般先用阴离子交换色谱柱Q-sepharose(先用梯度盐洗柱,然后加样,洗脱,收集结合物),再用SephadexG-200色谱柱除去游离的寡核苷酸。纯化后结合物中寡核苷酸和抗体之比为10:1,多数情况下,1个抗体分子可结合3~5个寡核苷酸。

        (三)RCA免疫组化染色

        (1)石蜡切片常规脱蜡至水,抗原修复后,PBS洗3×3min。

        (2)滴加特异性一抗,37℃孵育1h,PBS洗3×3min。

        (3)滴加适当稀释的寡核苷酸标记二抗IgG 200nmol/L(用100mmol/L谷氨酸钾-PBS稀释),37℃孵育30min,PBS洗3×3cm,用100mmol/L谷氨酸钾洗。

        (4)循环寡核苷酸(170mmol/L),用φ29缓冲液稀释[缓冲液内含250mmol/L(pH7.5)Tris-HCl,50mmol/L MgCl2,1mg/ml BSA,lmmol/L dATP,1mmol/L dCTP,1mmol/LdGTP,0.75 mmol/LdTTP,0.25mol/LFITC-12-dUTP],40ul/每片,37℃孵育30min,不洗,每张切片加入1ulφ29 DNA聚合酶(0.4U/ul),37℃继续反应30min,PBS洗3×3min。

        (5)免抗FITC-AKP结合物1:1000稀释,37℃30min;PBS洗3× 3min;0.02mol/LTris-HCl(pH9.0内含氯化镁、左旋咪唑)洗20min.

        (6)NBT/BCIP显色30~240min,核固红衬染。

        (7)常规树胶封片,结果观察。

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