间歇循环刺激法

一、材料和试剂
 

1.  抗原致敏供者的单个核细胞(MNC)和经过3 300 rad照射的自身MNC
 

2.  抗原
 

3.  含10%人AB型血清的完全RPMI 1640培养液
 

4.  细胞分离及T细胞培养增殖所需的其他试剂和器材
 

二、操作步骤
 

1.  抗原刺激：于24孔培养板加入单个核细胞5×10⁶ /2 ml/孔和最适浓度的抗原，置37℃，5% CO₂ 温箱培养7 d。
 

2.  间歇循环刺激：
 

（1）重悬经过抗原刺激的细胞，并经密度梯度离心，收集界面层细胞，用无血清的RPMI-1640洗二次；
 

（2）调整细胞浓度至1×10⁶ /ml，加入24孔培养板孔中，同时各孔加入经过照射的自身MNC 4×10⁶ ，以未照射的自身细胞作为饲养细胞和抗原提呈细胞，培养7d；
 

（3）同步骤（1）收集和洗涤细胞；
 

（4）调整细胞浓度至1×10⁶ /ml，与2～3×10⁶ 新鲜照射的自身MNC及抗原共同培养7d；
 

（5）重复步骤（2）～（4）共3个循环；
 

（6）收集细胞，通过增殖试验测定抗原的特异性。
 

3.  T细胞克隆：间歇循环刺激培养的细胞经有限稀释，于96孔板依次加入不同浓度的细胞悬液，同时克隆板孔中加入10⁴ 经过照射的自身MNC、IL-2 30 U和适当浓度的抗原，同上述条件培养7～10 d，显微镜下观察细胞生长情况。将生长良好的抗原特异性细胞转至24孔板孔中，加入自身饲养细胞和抗原，继续培养7 d，传代并经间歇刺激培养。

 

1.  上述方法制备的T细胞克隆未区分出CD4+和CD8+T细胞，二者均可能被克隆。
 

2.  在有限稀释之前，IL-2的量不宜过高，否则可能发生T细胞非特异性增殖。