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        AUTOMACS系统自动分选体系分选小鼠CD4+ CD25+抑制性细胞

        互联网

        2123
        PriCells: AUTOMACS 系统自动分选体系分选 小鼠CD4+ CD25+ 抑制性细胞

        实验材料:

        1. 小鼠

        2. HBSS洗涤缓冲液

        3. MACS缓冲液

        4. CD8a(Ly-2)磁珠

        5. 结合缓冲液

        6. biotin-抗CD25(7D4)

        7. Streptavidin-PE

        8. 抗PE磁珠

        9. 完全RPMI培养基

        10. 小鼠CD3+ T细胞富集柱和1×纯化柱缓冲液

        11. 15ml离心管,无菌

        12. autoMACS系统和分选柱

        13. 30mm尼龙网或40mm预分离滤膜

        实验方法:

        1. 用20只小鼠的淋巴结制备单细胞悬液并去除红细胞。

        2. 将细胞在20mlHBSS洗涤缓冲液中混悬后用血细胞计数器计数。

        3. 将细胞悬液在4℃,200g离心10min。离心过程中,准备3支小鼠CD3+ T细胞纯化柱,按说明书的指导用1×纯化柱缓冲液洗3遍。弃洗脱液,在每支纯化柱下方放置一支15ml离心管。

        4. 用3ml 1×纯化柱缓冲液和3ml HBSS洗涤缓冲液混悬细胞。将细胞通过30mm尼龙网或40mm预分离滤膜后,每支纯化柱中加入2ml细胞。室温孵育15min。

        5. 用2ml 1×纯化柱缓冲液洗涤纯化柱4或5遍以洗脱T细胞。用血细胞计数器计数后,将细胞悬液在4℃,200g离心10min。

        6. 将沉淀按每108 个细胞加0.9ml MACS缓冲液的比例混悬。每108 个细胞加入0.1ml CD8a(Ly-2)磁珠后4℃孵育15min。

        7. 4℃,200g离心10min。

        8. 以MACS缓冲液混悬细胞,使细胞浓度达到108 个细胞/ml。将细胞通过30mm尼龙网或40mm预分离滤膜。将细胞放到autoMACS的上样通道。选择depletes程序(CD4+ T细胞将从阴性通道洗脱。

        9. 回收细胞计数,在4℃,200g离心10min。

        10. 用结合缓冲液混悬细胞使其浓度达到108 个细胞/ml。每108 个细胞加入15mg biotin-抗CD25(7D4)。4℃孵育15min。4℃,200g离心10min。

        11. 用结合缓冲液混悬细胞使其浓度达到108 个细胞/ml。每108 个细胞加入7.5mg Streptavidin-PE。4℃孵育15min。

        12. 4℃,200g离心10min.

        13. 用MACS缓冲液混悬细胞使其浓度达到108 个细胞/ml。每108 个细胞加入0.1ml 抗PE磁珠。4℃孵育15min。

        14. 4℃,200g离心10min。

        15. 用MACS缓冲液混悬细胞使其浓度达到108 个细胞/ml。将细胞放到autoMACS的上样通道。选择posseld程序(CD4+ CD25+ 细胞将从阳性通道洗脱,CD4+ CD25- 细胞将从阴性通道洗脱。

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