免疫组化常见问题都在这里了

对于刚入门的科研小白，免疫组化步骤较为繁琐，而且一步错，步步错，有时候明明觉得自己都按照老师们提供的条件做，可惜就是没有得到预期结果，现我将自己的些许体会分享如下。

关于免疫组化的定义，原理，分类，优势等不再一一介绍（丁香园等主流平台都有介绍），我只叙述我认为「比较小」的问题，但这些往往决定了成败，遗憾的是我检索了比较多的资料，都没有详细的提及这些问题。

① 一定要按照标本的标本留取要求留取，譬如某组织要求固定前要求用湿润的生理盐水纱布，用干纱布则会大大影响实验效果，导致输在起跑线上。

② 制片厚度与均一程度很重要，若每张片子的厚度不同，则实验时所需条件的就会有差异，然我们不可能随意调整实验的反应时间，一般我们读研读博的医院都是研究型大学的附属医院，建议交由大病理科完成制片，由于某些科室有亚专科，由于成立时间相对较短，制片水平不如大病理科。

本人建议常规 4 ℃，背景浅，反应温和，但长须过夜。也有些试剂推荐 37 ℃，反应较快，最不提倡的是室温，因为波动较大，如果非得用室温，譬如 25 ℃，建议使用水浴恒温箱。

以抗体 1:1 000 稀释为例，枪头吸取 0.5 ul，首先这个很难观察到底取了多少，误差太大，假设不小心枪头外周沾了一抗很难察觉，所以建议梯度稀释法较妥，建议在不影响实验可换别的试剂，譬如 1:50 稀释，在误差不可避免的情况下降低影响。

最简单粗暴的方式是将所有玻片同时浸入泡缸内，但是由于试剂昂贵，此法基本不可行。

很多采用移液枪滴加（每次约 50～100 ul 就能解决问题），但这就带来了新的问题，假设有 10 张玻片，每滴加一张所需时间为 20～30 s，从第一张到最后一张相差将近 5 min，如果最后一张滴加完在开始计时，假设反应时间为 5 min，那么第一张片子实际反应时间为 10 min，而只有第 10 张玻片反应时间为 5 min。

此问题在单人操作中尤其明显，需要操作者把握时间。当然假设你的反应时间为 12 h，那么 5 min 我认为就可以忽略。

玻片反应是一定要平整放置，不然液体流动导致反应时部分组织干片，无法着色或染色时出现非特异性着色。

建议镜控，一张成功的免疫组化片子一定是轻松染色的，不用通过增加染色的时间来「提高」成功率，相反，一味延长染色时间容易导致非特异性着色。

在经过 PBS 浸泡后，不要企图将组织上的液体彻底插拭干净，因为这样更容易干片，尽量甩干，但组织周围的液体一定插拭干净，这样滴加上去的液体由于表面张力不易流动。

所有试验步骤操作方法均不难，难的是出现了问题如何取解决，由于整个流程中关键的步骤就那么 3～4 步，但是一旦出现问题，由于排列组合的原因，会出现多种组合，变得异常繁琐。所以一定要多思考。