一、问:用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移,有时发生快速变化,原因何在?如何解决?答:关于漂移问题:1. 温度控制不好,解决方法是采用恒温装置,保持柱温恒定2. 流动相发生变化,解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等3. 柱子未平衡好,需对柱子进行更长时间的平衡关于快速变化问题1. 流速发生变化,解决办法是重新设定流速,使之保持稳定2. 泵中有气泡,可通过排气等操作将气泡赶出。3. 流动相不合 ...
随着基因工程的发展,常常需要构建一种能高水平表达异源蛋白质的表达载体。启动子对外源基因的表达水平影响很大,是基因工程表达载体的重要元件。因此研究启动子的克隆方法,对研究基因表达调控和构建表达载体至关重要。 迄今为止,国外尚未见到有关启动子克隆方法的综述性报道,国内仅孙晓红等曾就启动子的结构、分类、克隆方法和食用菌中已经分离到的启动子作过综述。而近年来又有许多改进的克隆启动子的方法获得了多方面的 ...
1.3 环状PCR 环状PCR包括I-PCR(Inverse-PCR)和P-PCR(Panhandle-PCR)。这2种PCR都是根据一端已知序列设计的嵌套式引物进行PCR。 1.3.1 I-PCR I-PCR是1988年由Triglia最早提出的一种基于PCR的改进的染色体步行方法。 I-PCR的实验程序包括,基因组DNA经酶切后用T4DNA连接酶进行自连接,产生环状DNA片段 ...
2 讨论 以上介绍的几种方法基本代表了现有的启动子克隆方法,它们分别具有不同的特点和适用范围。 利用启动子探针载体筛选启动子时,不需要知道具体的基因序列,避免了引物设计,并能获得大量的启动子片段;其缺点是需要构建1个穿梭质粒,建库、转化、筛选,工作量大,费时费力,而且克隆、亚克隆的过程繁琐。因此在基因的遗传背景不是很清楚时,往往通过探针载体随机筛选启动子。 而PCR法的主要优点是简便、 ...
Peter Novick Lab Department of Cell Biology Yale University School of Medicine HOW TO PERFORM AN INTERRUPT OF ANONGOING AUTOCOUNT1). This program interrupts the ongoing autocount to allow the counting ...
1.4 利用载体或接头的染色体步行技术克隆基因启动子 这类方法的第一步都是酶切基因组DNA,连接载体或接头,既可以用pUCl8等质粒载体,也可以使用λDNA等噬菌体载体,只要选用的载体带有合适的酶切位点;同样根据实验需要,接头既可以是双链也可以是单链,然后根据基因组DNA序列设计的特异引物和载体的通用引物或接头序列进行扩增。 1.4.1 利用载体的PCR Shyamala等利用的单特异性 ...
1.6 TAlL-PCR 很早就有用随机引物的PCR,但由于无法有效地控制由随机引物引发的非特异产物的产生,所以一直未能广泛应用。近年来由IJiu等设计的TAIL-PCR(Termal Asymmetric Interlaced PCR)又叫热不对称交错PCR,则解决了这个问题,后来有研究表明,经改良过的TAIL-PCR成功地从突变体中克隆到外源插入基因的旁侧序列,从而为启动子的克隆提供了有效 ...
基因组(genome)包含的遗传信息经转录产生mRNA,一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的mRNA称为转录子组(transcriptome)。很显然,不同细胞在不同生理或病理状态下转录子组包含的mRNA的种类不尽相同。mRNA经翻译产生蛋白质,一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组(proteome)。同理,不同细胞在不同生理或病理状态下所表达的蛋白质的种类也 ...
基因工程:将不同的生命元件按照类似于工程学的方法组装在一起,生产出人们所期待的生命物质。内含子,外显子:一个基因往往由几个互不相邻的段落组成,它的内部还包含一段或几段最终不相应出现在成熟mRNA中的片段,称为内含子。而相应出现在成熟mRNA中的片段则称为外显子。基因:是一个含有特定遗传信息的核苷酸序列,它是遗传物质的最小功能单位。蛋白质的一级结构:多肽链的氨基酸顺序。蛋白质的二级结构:多肽链中有规 ...
专题一:RNA干扰技术(RNAi)1995年,康奈尔大学的Su Guo博士用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现,反义和正义RNA都阻断了基因的表达,他们对这个结果百思不得其解。直到1998年, Andrew Fire的研究证明,在正义RNA也阻断了基因表达的试验中,真正起作用的是双链RNA。这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的。这种双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干预(RNA ...
基因疗法是指将正常基因植入靶细胞代替病人细胞中的遗传缺陷基因,或关闭、抑制异常表达的基因,以达到预防和医疗疾病目的的一种临床医疗技术。在治疗遗传性疾病、恶性肿瘤、癌症、艾滋病病毒(HIV)、关节炎、糖尿病、腺苷脱氢酶(ADA)缺陷症、神经系统紊乱、心脏病等疾病方面,基因疗法发挥着越来越重要的作用。基因治疗中最重要的一个环节是选择适当的基因载体(Vector)。基因治疗载体一般分为病毒性载体和非病毒 ...
基因突变是指由于DNA碱基对的置换、增添或缺失而引起的基因结构的变化,亦称点突变。它的分类方式包括1)根据基因结构的改变方式,基因突变可分为碱基置换突变和移码突变两种类型;2)根据遗传信息的改变方式,基因突变又可以分为同义突变、错义突变和无义突变三种类型。基因突变的检测方法:从基因突变的性质来看,检测方法分为显性突变法、隐性突变法和回复突变法三类。广义的突变?检测可以从两个层次来入手:一个是蛋白质 ...
1 如果是染色体畸变,你可以用正常细胞的染色体与药物处理过的细胞的染色体对照进行检查,大致确定好事那个染色体后用FISH技术来检测染色体2 如果是基因发生了点突变,首先要明确是那个基因会有发生突变的趋势,采用SSCP(单链构象多态性)确定是否发生有突变,然后用测序法验证3 如果已知该药物所导致的突变,就可以采用测序,单碱基延伸法等方法进行检测 ...
T-RFLP的主要原理与步骤大体如下:1.提取DNA;2.设计1-2对通用引物(主要根据16S rRNA基因)进行PCR扩增,(每对引物的1条5'端标记荧光);3.产物纯化后酶切.每组酶切产物中只有一条片段末端标记了荧光.4.酶切产物通过毛细管电泳或测序胶电泳荧光扫描.5.结果分析:每1个荧光峰至少代表1个细菌或几个近缘的细菌峰面积可粗略认为与细菌在某一部位的微生态群落中的数量. ...
T-RFLP中文可翻译为:末端限制性片段长度多样性,又可以称为16sRNA基因的末端限制性片段分析技术。是一种新兴的研究微生物多态性的分子生物学方法,日亦受到研究人员的重视。该技术已经成功应用于各种微生物群落的分析比较、研究微生物群落多样性及结构特征等多方面。T-RFLP的技术原理是根据的保守区设计通用引物,其中一个引物的5‘末端用荧光物质标记,常用荧光物质有HEXTET6-FAM等。提取待分析样 ...
一、核酸的纯化 在分子克隆的所有操作中,最基本的操作是核酸的纯化。其关键步骤是去蛋白质,通常只要用酚/氯仿。氯仿抽提核酸的溶液即可。每当需要把克隆有某一些所用的酶灭活或去除以便进行下一步时,可进行这种抽提。然而,如要从细胞裂解液等复杂的分子混合物中纯化核酸,则要先用某些蛋白水解酶消化大部分蛋白质后,再用有机溶剂抽提。这些广谱的蛋白酶包括链霉蛋白酶及蛋白酶K等,它们对多种天然蛋白均有活性,(1)用 ...
该技术在应用的过程中,肯定需要在实验条件上不断进行改进,而这种改进的好坏自然而然需要实验结果的验证。。V. Grüntzig在2002年做了该工作的一部分,结果认为,在限制性酶切时,很有必要去除其中影响DNA的酶切过程,并且实验证明了具体的酶切时间。具有说服力的结果如下: 1,T-RFLP出数据的速度快,不过只是具有半定量性;2,DNA片断的分离有两种常用的方法:1。1 凝胶电泳,近来使用的比较 ...
DNA电泳(主要内容如下) Preparation of Agarose Gel and Electrophoresis Extraction of DNA From Agarose Gel Extraction of DNA from Acrylamide Gels DNA Marker Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Two ...
Southern杂交One important thing for transfer:the weight of the object resting on top of the blotting apparatus should not exceed the weight equal to a 500 mL half full bottle for it will give your (nitr ...
DNA转染・ Transfection of Mammalian Cells Using Lipofectamine (LTI) ・ Guide to Eukaryotic Transfections with Cationic Lipid Reagents (PDF) (LTI) ・ Transfection of Mammalian Cell ( ...