质粒

为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如 ...

外源DNA和质粒载体的连接反应外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两种酶 ...

看了下面的文章，我觉得◎＃￥％％￥＃◎碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖 /25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么50m ...

琼脂糖糖凝胶电泳，是一门常规技术，需要熟练掌握。1．目的学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳、。2．原理DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。3．器材电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，250ml三角瓶，微波炉，台式离心机，旋涡混合器，凝胶成像系统，分光光度计，微量移液取样器，1.5ml离心管，双面微量离心管架，试管 ...

【鸡毛蒜皮】之3重组质粒是“筛”出来的吗？重组质粒的筛选是质粒构建的重要步骤，重组子是筛出来的，这个命题没有问题。问题是最关键步骤不在筛选。影响重组质粒构建效率的最关键步骤在于酶切，不管是否是定向克隆还是非定向克隆。酶切的关键在于切干净，彻底的酶切反应是成功的一半，尤其是载体的酶切。1）酶切反应的前提是对质粒载体的大致定量，一般大小的质粒（3－5kb）一次连接的用量在100ng左右，一般挖胶回收的损失在50%左右，为 ...

我做质粒小量提取,刚开始的几次实验都没有理想的结果,分析来分析去发现问题可能是培养时间的问题:将菌种从-70度接到LB培养基37度过夜,再用此菌液涂平板获得单克隆,用EP管取1.5毫升LB培养基,用接种环每挑一个菌落每接种一管(将挑到的菌落全洗下去),37度培养约13个小时,直接按照"分子克隆"提供的碱裂法提,结果一无所获.后来在师兄的提醒下我想到是否是因为培养时间过长而使质粒缺失?于是我测了此菌的大致生长曲线,发 ...

质粒DNA的提取与鉴定( 一)收获细菌（1）将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ML的试管中，接入一单菌落，于37度剧烈振荡培养过夜（2）将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，用台式离心机于4度以12000g离心5min，将剩余的培养物储存于4度（3）吸尽培养液，使细菌沉淀尽可能干燥2碱裂解法小量抽提质粒　　（1）将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/l Tris –HCl ...

本人有大量的资料资源，有需要的朋友欢迎来交换，邮箱：1739507720@qq.com：质粒类别抗性详细信息pGEX4T-1大肠杆菌质粒AmppGEX4T-2大肠杆菌质粒AmppGEX4T-3大肠杆菌质粒AmppGEX-6P-1大肠杆菌质粒AmppGEX-6P-2大肠杆菌质粒AmpPGEX-KG大肠杆菌质粒AmppGEX-6p-Caspase大肠杆菌质粒AmppET3a大肠杆菌质粒AmppET3b大肠杆菌质粒Am ...

1：DH5a菌株DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA12：BL21(DE3) 菌株该菌株用于高效表达克 ...

表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段（4） P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加 poly（A）信 ...

1．目的学会用限制性内切酶切割质粒DNA。2．原理II型限制性内切酶能识别双链DNA内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电泳酶切后的DNA混合物能够确认和分离酶切片段。3．器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，水漂，恒温水浴。4．试剂Pinpoint™xa-3质粒，EcoR V，BamH I，内切酶缓冲液（10×），10×电泳加样缓冲液，荧光染料。5．实验 ...

外源DNA和质粒载体的连接反应外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５'磷酸和相邻的3'羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两种酶 ...

如需提供发票，还需要额外增加15%的费用（免费提供载体图谱或序列）载体名称载体抗性载体价格载体名称载体抗性载体价格PET11bAmp+300元（2-4ug）PCALSL-mir30Amp+500元（2-4ug）PET12aAmp+300元（2-4ug）PESC-HisAmp+500元（2-4ug）PET16bAmp+300元（2-4ug）PESC-LEUAmp+500元（2-4ug）PET23bAmp+300元（2-4ug）PESC ...

走过很多弯路,也做了许多无用功,现在终于有了一点经验,拿出来请大家指教电转化protocol:a.incubation in MRS (10mL)with 1% glucose for 6 hours till OD600=0.4-0.6b.Pretreated with 10ng/mL Ampicillin for 60 minc.Washing with washing buffer two times, and then washing with electroporation buffer one time, resusp ...

复旦大学生化与分子生物学实验室碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。可以我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。这是导致我的学生误入歧途的主要原因。后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多“老师”也 ...

接手一个2.9kb的克隆构建，装入到EGFP-N3上，选择Xhol/BamhI,片断和质粒酶且完毕，可是怎么也连不上，无奈换酶切位点，换为SalI/BamhI，可是同样问题出现了，怎么也连不上! 无奈先换成克隆半段1.5kb，SalI/BamhI的位点，非常容易得得到克隆， 可是还要全长的啊，在中间靠上的位置找了个unique的酶切位点ppumI，然后把下半段的P出来，使用ppumI/BamhI切好，把构建好的上半段的克隆也使 ...

端粒长度的测量方法，是通过实时荧光定量PCR进行的，希望对做端粒的同行有所帮助！文件613k，无法上传，贴前言来共享吧。INTRODUCTIONThe traditional method of measuring telomere length insamples of total human genomic DNA determines a meanterminal restriction fragment (TRF) length (1). The methodrequires large a ...

这一方法简单, 省钱, 不用酚/氯仿, 可用于酶切鉴定和转染细胞测试表达情况(尤其是直接观察表达情况的荧光表达载体). 具体操作步骤如下:Miniprep Plasmid Extraction1. Grow bacteria O/N at 37°C with vigorous aeration in 3 ml LB or 2xYT with appropriate antibiotic.2. Harvest by micro-centrifugation at maximum rpm (16000g) for 1 min (keep the 1 ml left ...

这种方法抽提的质粒质量和浓度都不错，是我们实验室根据标准方法改进后总结出来的，和大家共享，希望能加点分。1、前一天晚上将要抽提的菌种接种一单菌落到盛有100mL 液体培养基的500mL三角瓶中，于37℃，250rpm摇床培养过夜。2、将此培养液转移至2个50mL离心管中，5000rpm离心10分钟，弃上清液。3、向2个离心管中各加5mL SolI，剧烈振荡使菌体尽可能均匀重悬。4、向2个离心管中各加10mL SolII，轻轻颠 ...

最近在做质粒提取方面的实验，搜集了相关资料与大家分享，这是传统提质粒的方法，与试剂盒提质粒不同，通过这个过程大家可以更好的明白实验原理。1．目的学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。2．原理根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧 ...