抗原设计

甲基化荧光PCR检测 甲基化荧光检测(methylight)是利用荧光定量性PCR检测亚硫酸氢钠处理后的序列改变。在TaqManR技术中，可以使用3种不同的单核苷酸(正义引物、反义引物和荧光杂交探针)，进行不同序列的检测。与已存在的技术相比，甲基化荧光检测最明显的优点就是能同时对几百甚至几千例样品迅速检测。 高敏感、快速是本方法最显著的特点，它可以在非甲基化等位基因超出10 ...

酶的区域性甲基化特异性分析(ERMA) 酶的区域性甲基化分析是一种定量区域性CpG甲基化密度研究方法。基因组DNA在亚硫酸氢钠处理后，感兴趣的区域由包含dam位点的引物扩增。扩增后的PCR产物与14C标记的SAM及dam甲基转移酶温育，作为标准DNA定量的内参照。之后将3H标记的SAM和M．SssI甲基转移酶温育。在每个检测中使用具有确定甲基化位点细胞系DNA的标准混合物，每个样品的3H／ ...

组蛋白乙酰化的研究方法 1．HAT活性的测定 HAT可以催化放射性标记的乙酰辅酶A掺人核心组蛋白(有的选用H4氨基末端的14个氨基酸短肽)底物，然后测定掺人的放射性强度可以确定HAT的活性。HAT的活性单位定义为30~C时，将1pmol醋酸在10rain内掺人小牛胸腺组蛋白所需的酶量。 2．HDAC活性的分析 HDAC活性的检测比较烦琐。 3．染色质免疫沉淀技术 ...

甲基化敏感的单核苷酸的扩增(Ms―SnuPE) Ms―SnuPE即甲基化特异的单核苷酸扩增，它能对不同甲基化特异位点进行快速定量，是一种快速估计特异性CpG位点甲基化不同情况的定量方法。 先用重亚硫酸盐处理基因组DNA，未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。进行PCR扩增，然后取等量扩增产物置于2管中，分别作为Ms―SnuPE单核苷酸引物延伸的模板。设计用于Ms― ...

DNA甲基化在肿瘤诊断中应用 表观遗传学吸引入的地方就是在肿瘤的早期检测中的应用，因为研究表明表观遗传的变化伴随肿瘤的发生与发展，使用表观遗传学方法可以有助于肿瘤的早期发现。现在肿瘤表观遗传治疗的主要研究方向包括DNA甲基转移酶和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的研制及靶向诱导DNA甲基化等。 癌症的早期发现对癌症患者的有效治疗是非常重要的。目前对癌症的诊断主要依据临床症状、图像信号检测和组织 ...

细胞凋亡信号途径 细胞凋亡本质上是一种程序性细胞死亡，是机体在生理或病理条件下，启动自身内部机制，经过多途径的信号传递，结束其自身生命的过程。细胞凋亡具有特征性的形态学及生物化学改变。凋亡早期主要表现为胞质空泡，染色质浓缩并沿核膜排列；凋亡细胞与细胞外基质或周围细胞分离。随着凋亡过程的进展，胞质空泡与胞膜融合，导致膜发泡，随后空泡与细胞分离，引起水分丢失，细胞皱缩，同时染色质进行性固缩，并 ...

Ras信号通路 很多生长因子如EGF、PDGF、FGF等激活受体酪氨酸激酶后，通过中介分子可活化由原癌基因FaS编码的Ras蛋白，后者能进一步催化其底物蛋白的酪氨酸磷酸化反应，并引发蛋白磷酸化的级联反应，最终导致细胞的增殖效应。由于Ras蛋白为多种生长因子信号转导过程所共有，故把此信号转导途径称为Ras通路。 Ras蛋白是癌基因las的编码产物，人类有3种ras基因，即H―FaS、K ...

P38MAPK信号转导通路 分裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)家族是非常保守的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，是信号转导过程中一组主要的信号分子，在发育和疾病发生过程中起重要作用。该家族有4个成员，即细胞外信号调节激酶(extracellular regulated proteinhnase l／2，ERK 1／2)，c―jun N ...

激光共聚焦法检测外源性TFPI-1与大鼠MsC膜上TF的结合情况外源性加入组织因子途径抑制物-1(tissue factor pathway inhibitor-1，TFPI-1)能够诱导大鼠肾小球系膜细胞发生凋亡。TFPI-1是组织因子(tissue factor，TF)的天然抑制物，TFPI-1的Kunitzl结构域能与TF-Ⅶa复合物结合。通过免疫荧光检测发现大鼠肾小球系膜细胞膜上有TF的 ...

免疫组织化学-体内原位检测信号分子表达变化 免疫组织化学染色是引入附有标记物的外源性抗体(或抗原)，使之锚定于组织或细胞标本中相应的抗原(或抗体)部位，标记物经呈色反应而显示代检抗原(或抗体)，因此，免疫组织化学可按标记物的种类以及定位方法分类。按标记物分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫金银法、放射免疫自显影法等；按定位方法则分为一步法(又称直接法)、二步法(包括间接法、夹心法、补体法)和多步 ...

免疫印迹法检测MAPK信号通路表达改变 肾小球硬化的主要发病机制之一是细胞外基质(ECM)的异常沉积。转化生长因子p1(TGF-B1)在ECM沉积中起作用，并与MAPK信号通路有密切关系。醛糖还原酶(AR)是多元醇代谢通路中的限速酶，研究证实AR基因为大鼠肾小球肾炎及肾脏硬化过程中系膜细胞(MsC)的TGF-6l反应性基因之一。以蛋白质印迹检测正常MsC、AR转基因MsC、应用醛糖还原酶抑 ...

亲和免疫组织化学ABC法检测Thy-1肾炎过程中肾小球内TFPI-1的表达TFPI-1是体内主要的生理性抗凝物质，除具有抗凝作用外，还有抗炎、抗血管生成、 抗增殖及诱导细胞凋亡等多种功能。研究证明，系膜细胞能分泌TFPI-1。为研究TFPI- 1是否对肾小球肾炎具有一定的疗效，首先应用亲和免疫组织化学ABC法观察了在大鼠Thy-1肾炎过程中TFPI-1的表达情况。 1．方法 (1 ...

细胞凋亡与肿瘤发生 肿瘤的发生是多种因素相互作用导致正常细胞恶变的结果。导致肿瘤发生的外源性因素包括化学、物理、致瘤性病毒和真菌素等，内源性因素则包括肌体的免疫状态、遗传因素、激素水平、DNA损伤、原癌基因的激活和抑癌基因的失活等。归根到底，导致肿瘤发生的核心因素是基因调控的失常，典型表现是肿瘤细胞增殖和死亡速度之比的失衡，其中非常重要的一点便是细胞凋亡的抑制。 从细胞生物学的角度 ...

免疫荧光单标记和双标记的方法 l免疫荧光单标记方法 免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。具体染色方法如下。 1)所需材料与试剂 (1)培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60％一70％的细胞。 (2)一抗、FITC或TRITC标记的二抗 ...

激光扫描共焦显微镜的应用 激光扫描共焦显微镜(confocal laser scanning microscopy，CLSM)在传统荧光显微镜成像的基础上加装了激光扫描装置，利用紫外或可见激光激发荧光探针，对生物样品进行断层扫描，结合计算机对荧光图像进行加工处理，观察细胞和组织内部各个层面或不同侧面的形态变化。激光扫描共焦显微镜集激光技术、电子技术、光学设计及计算机于一体，它的优势为具有更 ...

caspase家族 自从确定ced-3在线虫细胞凋亡中的作用以后，人们投入了大量精力分离哺乳动物同源基因。1993年，Miura等首先发现哺乳动物的白细胞介素-1p转化酶(interleuhn-1Β convertingenzyme，ICE)与ced-3同源，并证实了ICE在哺乳动物细胞凋亡中的作用。在以后的几年中，有十几种ced-3同源基因被发现。由于某些ced-3同源基因由多个实验室同 ...

死亡受体家族与诱导细胞凋亡的外在通路 死亡受体家族的发现是与肿瘤的治疗密切相关的。早在1868年，人们注意到某些肿瘤患者在受到细菌急性感染时肿瘤会自然消退。后来，人们从细菌中分离到一种使肿瘤消退的毒素，即细菌内毒素(endotoxin)。用这种内毒素处理过的小鼠血液含有诱导肿瘤坏死的因子。1984年，Pennica首先克隆到编码这种血液因子的cDNA，即肿瘤坏死因子(tumor necro ...

细胞凋亡的分子生物学研究 20世纪90年代以来，随着分子生物学技术手段的日新月异，精密仪器设备层出不穷，推动生命科学领域的研究迅速进入到基因调控和蛋白激活及其引起的信号转导途径等微观变化，对凋亡的研究也更趋向于凋亡的分子机制和动态的过程变化。与此同时，20世纪肿瘤的研究在经历了70年代的癌基因时代、80年代的抑癌基因时代，到了90年代则进入了多基因，或者信号转导网络时代。正是在这一时期，大 ...

线粒体和凋亡 Mitchell于1967年提出了线粒体在氧化磷酸化过程中的作用，据此在1978年获得诺贝尔化学奖。此后线粒体的功能被定性为细胞的“动力工厂”，通过氧化磷酸化为细胞提供能量，因此不再受到重视。直到后来发现凋亡相关基因Bcl-2家族位于线粒体表面后，线粒体在凋亡中的作用又引起了广泛的关注，并且很快发现线粒体与凋亡的关系极其密切。凋亡诱导基因Bcl―2家族的不同家族成员与线粒体表 ...

Annexin V-PI双染法 在细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在DNA片段化之前，因而检测PS的表达，能反映早期凋亡。AnnexinV是相对分子质量为35 000大小的Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS有很高的亲和性，并且可以与暴露于细胞外的PS相结合。利用这一原理，可以将AnnexinV标记荧光来 ...