免疫组织化学实验

免疫荧光组织化学直接法 (1)检查抗原法：此法是免疫组织化学最早使用的方法，用荧光素标记已知特异性抗体，直接与组织细胞中相应抗原结合，在荧光显微镜下可见抗原存在部位呈现特异性荧光。此法特异性强，快速而简便，但是，由于一种荧光抗体只能检测一种抗原，很难获得各种市售的特异性荧光标记抗体；此外，该方法敏感性较低。(2)检查抗体法：将抗原标记荧光素，即为荧光抗原。将此荧光抗原直接与细胞或组织内相应 ...

免疫荧光组织化学间接法 (1)检查抗原法：第一抗体不标记，使用与一抗种属相同抗体的Fc段(有种属特异性)作为抗原免疫动物，制备抗抗体。即第二抗体。并用荧光素标记第二抗体。反应时，首先用特异性抗体(第一抗体)与组织细胞中的相应抗原反应，然后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再用荧光素标记的第二抗体与结合在抗原上的第一抗体结合，形成抗原―抗体―荧光抗体复合物。由于结合在抗原―抗体复合物上的荧光抗 ...

间接法免疫荧光组织化学染色步骤 1．检测抗原法以单层细胞培养标本为例介绍此法的染色步骤： (1)取出细胞贴附生长的小盖片，用预热的PBS冲洗2次； (2)4％多聚甲醛(或冷丙酮)固定5～10分钟，晾干； (3)0．01MPBS(pH 7．4)漂洗3次，每次5分钟。 (4)0．3％Triton X-100孵育，室温20分钟，PBS漂洗2次(细胞膜抗原可省略此步骤)； ...

SABC―Cy3法免疫荧光组织化学染色步骤 在免疫荧光组织化学技术中，常用方法还有SABC-Cy3法。它的基本原理和染色步骤与免疫组织化学中SABC法大体相同，唯一不同的是亲和素―生物素―辣根过氧化物酶复合物中的酶组分被荧光素Cy3替代，从而形成亲和素―生物素-Cy3复合物，故称之为SABC―Cy3法。在其染色步骤中没有酶与底物和供氢体的显色作用，取而代之的是荧光素染色。由于Cy3所产生的 ...

原位杂交组织化学杂交体检测 杂交体检测又称杂交体显示，是指通过一定方法使杂交反应形成的杂交体(杂交信号)成为在显微镜下可识别的产物。对原位杂交反应信号进行显示的方法因探针标记物不同而异。 (一)放射性核素标记探针的检测 第一个原位杂交实验(1969年)以’H作为核酸探针的标记物，杂交信号用放射自显影术检测。随着原位杂交技术的推广和应用，32P、125I及35S等放射性核素均可用 ...

原位杂交组织化学杂交后处理 杂交后处理的目的是除去未参与杂交体形成的过剩探针，解除探针与组织标本之间的非特异性结合，包括那些与靶核酸相似的序列和探针之间形成的含非互补碱基对的杂交体，从而减低背景，以获得较高的信噪比。 杂交后处理主要包括系列不同浓度和不同温度盐溶液的漂洗。洗涤条件(盐浓度、温度、洗涤次数和时间)因核酸探针类型和标记物不同而略有差异，一般而言，盐浓度由高到低，而温度由 ...

双重和多重原位杂交技术 为了在同一标本上或同一细胞内同时检测是否存在两种或两种以上的靶核酸序列。可应用双重或多重原位杂交技术．即以两种或多种标记探针与靶核酸杂交。然后利用不同的检测手段分别显示各种靶核酸的存在和分布。该技术与免疫组织化学技术中的双重或多重标记相似，除了探针本身的特异性外，对结果的干扰主要来自标记物及检测试剂的互相影响。 （一）放射性核素和非放射性标记探针的双重标记原 ...

PCR扩增标记法探针标记 PCR扩增标记法的原理与普通的核酸PCR相同。即Taq DNA多聚酶以DNA为模板，在特异引物引导下，在PCR仪中合成cDNA探针。由于在反应体系中加入一定量的标记dNTP，因此扩增的同时又是一个标记过程。cDNA探针PCR扩增法标记原理末端标记法探针标记缺口平移法探针标记随机引物法探针标记探针标记物原位杂交组织化学杂交前处理原位杂交组织化学基本程序原位杂交组织化 ...

荧光原位杂交技术 荧光原位杂交技术(florescence in situ hybridization，FISH)是一种利用荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。它将荧光信号的高灵敏度、安全性及直观性和原位杂交的高特异性结合起来，通过荧光标记的核酸探针与待测样本核酸进行原位杂交。在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体或基因异常的细胞和组织样本进行检测和诊断，为各种基因相关疾病 ...

原位杂交组织化学基本程序 根据所用探针的种类和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA－DNA杂交，DNA－RNA杂交和RNA－RNA杂交三类。因原位杂交多用于检测组织细胞内的mRNA及其表达，故DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交较多见，DNA-DNA杂交主要用于染色体原位杂交以对染色体中的DNA进行定位。 根据探针的标记物是否能直接检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。在直接法 ...

胚胎原位杂交技术 通过分析mRNA在不同发育时期组织中的表达变化，有助于了解胚胎发育的基因调控机制。原位杂交是研究胚胎基因表达的常用方法，在发育生物学研究中起重要作用。胚胎原位杂交包括全胚胎原位杂交和胚胎组织切片原位杂交。 全胚胎原位杂交技术(whole mount in situ hybridization)可以从整体水平反映胚胎发育过程中基因表达的时空顺序，是一种广泛应用于胚胎 ...

原位杂交结台免疫组织化学技术 原位杂交结合免疫组织化学技术主要用于在同一细胞内同时或先后检测特定基因在核酸和蛋白质或多肽水平的表达，这样。不仅能了解基因表达，而且还能研究某种基因表达的翻译和转录调节。如果免疫组织化学检测的抗原成分是与原位杂交的靶核酸不同基因编码的蛋白质或多肽等，那么同时使用原位杂交和免疫组织化学技术可研究一种基因的转录与另一种基因编码的蛋白质合成之间的相互关系。在病毒学研 ...

原位杂交组织化学标本制备 (一)取材 用于原位杂交反应的组织应尽可能新鲜，因此要求取材迅速。由于很多RNA极易降解，取下的组织应尽可能迅速固定或冷冻。为了避免外源性RNA酶引起靶组织中RNA丢失，取材时应戴手套，所用的器械、容器都要经高压消毒，或清洁后用经焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)处理过的灭菌蒸馏水清洗。此外，避免用手直接接触组织、器械、容器和 ...

原位杂交组织化学杂交前处理 杂交前处理的目的在于提高组织通透性。增加靶核酸的可及性以及防止RNA或DNA探针与组织细胞或载玻片之间的非特异性结合，从而增强杂交信号，降低背景。杂交前处理的具体方法和步骤因所采用的固定剂、组织标本以及探针不同而异。用温和的非交联固定剂固定的细胞培养标本和冰冻切片，不需经特殊的杂交前处理，一般均能获得较好的杂交反应结果。而用交联固定剂固定的标本。尤其是福尔马林固 ...

常用电镜原位杂交技术的基本程序 原位杂交技术自创立以来，为基因的定位和表达、基因进化、发育生物学、肿瘤学、微生物学、病理学、医学遗传学和遗传分析等领域研究提供了极其宝贵的资料，发挥了其他技术难以取代的作用。但不论是使用放射性核素探针，还是非放射性探针，大部分研究工作都还限于光镜水平。为了对检测的靶核酸进行更精确的亚细胞定位，以及能观察含靶核酸序列细胞的超微结构，人们便将原位杂交与电镜技术相 ...

免疫电镜技术组织的取材与固定 免疫电镜技术是根据抗原与抗体特异性结合的原理，利用高电子密度的标记物标记抗体或用经免疫组织化学反应能产生高电子密度产物的标记抗体，在超微结构水平对抗原进行定性、定位的技术方法。Singer于1959年首先建立了用电子密度较高的铁蛋白(ferritin)标记抗体的方法，可对细胞表面抗原进行超微结构定位。该技术为免疫电镜技术的发展奠定了基础。Nakane与Pier ...

电镜原位杂交的特点 电镜原位杂交的原理和基本操作步骤与光镜水平的原位杂交相似，但电镜原位杂交不仅要求获得满意的杂交信号，而且还要求保持良好的超微结构。为了兼顾既保存较好的细胞超微结构又保证较好的杂交反应两者之间的关系，在电镜原位杂交中应注意以下几个特点： 1．选择合适的固定剂 所用固定剂最好为交联固定剂，如甲醛和戊二醛，既能良好保存细胞超微结构，又能有效地保存组织细胞中的核酸，尤 ...

肽核酸原位杂交 肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)是20世纪90年代初发现的新型DNA／RNA同类物，是一类人工合成的以电中性的肽链酰胺2―氨乙基甘氨酸组成的多聚酰胺键取代DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架而形成的类似核苷酸的物质。像传统的DNA序列那样，PNA寡聚体的氨基末端相当于DNA的5’端，其羧基末端相当于DNA的3’末端。尽管PNA单体也具有一个游离的氮末端和 ...

免疫电镜技术的染色方法 免疫电镜技术与光镜免疫细胞化学染色方法的基本原理和试剂准备基本相同，相关内容可参考本书第四章，这里仅介绍免疫电镜的几种染色方法，包括包埋前染色、包埋后染色和冰冻超薄切片免疫染色三种。 1．包埋前染色 包埋前染色即在进行常规电镜包埋处理前先行免疫组织化学染色，然后于解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出，修成2～4mm3大小的组织块，再按常规电镜方法处理，包括戊二 ...

免疫胶体金电镜技术 胶体金标记抗体技术建立于20世纪70年代初，因胶体金液呈樱桃红色，故标记抗体后进行免疫染色，可直接光镜观察。金颗粒的电子密度相当高，电镜下清晰可辨。因此近年来该技术被广泛应用于生物学和医学各领域的电镜研究，自20世纪80年代开始，有取代免疫酶细胞化学电镜技术之趋势。目前。国内外已有不同直径的金颗粒标记的各种间接抗体(第二抗体)商品出售，实验需要时可直接购买。 该 ...