化学生物学实验技术

1 能量传递法：Heller等设计用两个紧接的探针，一个探针的一端用化学发光基团（供体）标记，另一个探针的一端用荧光物质标记，并且这两个探针靠得很近。两个靠得很近的探针用不同的物质标记（标记光发射），当探针与特异的靶杂交后，这些标记物靠得很近。一种标记物发射的光被另一种标记物吸收，并重新发出不同波长的光，调节　检测器使自动记录第二次发射光的波长。只有在两个探针分子靠得近时，才能产生受激发光，因此 ...

　　总的来说，随探针浓度增加，杂交率也增加。另外，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。依我们的经验，要获得较满意的敏感性，膜杂交中32P标记探针与非放射性标记探针的用量分别为5～10ng/ml和25～1000ng/ml，而原位杂交中，无论应用何种标记探针，其用量均为0.5～5.0μg/ml。探针的任何内在物理特性均不影响其使用浓度，但受不同类型标记物的固相支持物的非特异结合特性的影响。　　 ...

①先将膜在水中浸湿，再放到15×SSC中。　　②将DNA样品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。　　③用铅笔在滤膜上标好位置，将DNA点样于膜上。每个样品一般点50μl（2～10μg DNA）。　　④将膜烘干，密封保存备用。 ...

（1）采集外周静脉血10ml，加1.7ml ACD（柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml0.6kg/cm2灭菌30min）抗凝。　　（2）将血液放入已灭菌的50ml塑料离心管内，加30mlSTMT，轻轻上下振荡至透明，红细胞完全溶解。　　（3）冰浴10min，离心，3000rpm，10min。弃上清，STMT重复处理1～3次。　　（4）弃上清，白色沉淀物加10m ...

　　1．收获细菌　　（1）将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中，接入一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。　　（2）将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，用台式离心机于4℃以12000g离心5min，将剩余的培养物贮存于4℃。　　（3）吸尽培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。　　2．碱裂解法小量抽提质粒　　（1）将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡 ...

1）膜的处理：戴上干净手套，取出硝酸纤维膜，按需要剪成一定大小，量好各样点间距离，用软铅笔标记。　　2）DNA变性：将DNA溶液于1×TE（pH8.0）缓冲液中或蒸馏水中，取一定量DNA样品加于小塑料管中，在100℃沸水中煮10min，迅速入冰水中。　　3）点样：用塑料或硅化玻璃或微量加样器取1～5μl变性DNA，将滴管放在硝酸纤维膜上，使DNA慢慢吸在滤膜上，点样完后凉干。　　4）固定：将凉干的 ...

　　1．酶切反应　　（1）在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6μl，10×Buffer 1μl，DNA 2μl，酶1μl，混匀，37℃水浴1h以上。　　（2）取反应物点样，观察酶切效果。　　（3）酶切完全后，70℃5min终止反应。　　2．琼脂糖电泳　　（1）配制所需浓度琼脂糖凝胶。　　（2）在待测的DNA样品中加1/5体积的溴酚蓝指示剂，混匀后点样。　　（3）打开电源开关，5V/cm电 ...

　　基因诊断是以核酸分子杂交技术为基础，在核酸水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷和一些传染病病原体的方法。其基本过程是：制备DNA探针，标记探针，检测样本。开展这项工作的关键是要得到高灵敏度、高特异性的探针。以往人们是用放射性同位素来标记探针DNA。近年来，非同位素标记方法发展很快，已有取代同位素标记法的趋势。地高辛配基随机标记DNA探针法，是较为成功的一种非同位素标记方法。其原理是：用化学方法把类 ...

（1）在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6μl，10×Buffer 1μl，DNA 2μl，酶1μl，混匀，37℃水浴1h以上。 　（2）取反应物点样，观察酶切效果。　　（3）酶切完全后，70℃5min终止反应。　　（4）加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀，-20℃2h以上。　　（5）15000rpm离心15min，弃上清。　　（6）加入75%乙醇洗涤2 ...

Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶不同于大肠杆菌ＤＮＡ连接酶，它可以催化平端ＤＮＡ片段的连接（Sgaramella和Khorana1972;Sgaramella和Ehrlich1978），由于ＤＮＡ很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性，才能使任何ＤＮＡ分子彼此相连。然而，相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下４个条件：１）低浓度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sg ...

　　1．缺口平移　该技术由Kelly等于1970年创立。其原理是首先用DNA酶在双链DNA探针分子的一条链上制造一些缺口（nick ）缺口处会形成3’—羟基末端，这时再在大肠杆菌DNA聚合酶I的催化下将核苷酸残基加在3’－羟基上，同时，根据大肠杆菌酶DNA聚合酶I的5’→3’核酸外切酶活性，此酶将缺口5’侧核苷酸依次切除。其结果是在缺口平移（nick tr－anslation）。根据这个原理，如果 ...

　　1．光敏生物素标记核酸　目前使用的光标生物素试剂有两种：光生物素（乙酸盐）和补骨脂素生物素。它们都是由一个光敏基团、一个连接臂和一个生物素基团组成。光生物素的光敏基团是-N3，它在光作用下可与核酸中的碱基结合。补骨脂素生物素中的光敏基团补骨脂素在光照（320～400μm）下，可与单链或双链核酸发生反应，反应主要在T上，C上也有一定程度的反应。光敏生物素的连接臂含6～12个碳原子，用以减少探针杂 ...

　　RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高。早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的，标记效率往往不高，且受到多种因素的制约。这类RNA探针主要用于研究目的，而不是用于检测。例如，在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病毒（HIV）的基因组DNA克隆时，因无DNA探针可利用，就利用HIV的 ...

　　cDNA（complementary DNA）是指互补于mRNA的DNA分子。cDNA是由RNA经一种称为逆转录酶（reverse transcriptase）的DNA聚合酶催化产生的，这种逆录酶是Temin等在70年代初研究致癌RNA病毒时发现的。该酶以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA（其中U与A配对）。这一途径与一般遗传信息流的方向相反，故称反向转录或逆转录 ...

标记物性质标记分子标记方法杂交体的检测法放射性分子α-32PdNTPNT、PCR、RPI放射自显影或计数　γ-32PdNTPTL放射自显影或计数　125I碘化放射自显影或计数　35SNT放射自显影或计数　3HNT放射自显影或计数非放射性分子　　　生物素Bio-11-dUTPNT、TL、PCR酶标亲合素或酶标抗生物素抗体显色　光敏生物素600W 可见光照同上　生物素化补骨脂素365nm紫外线照同上　 ...

(１）用适当的限制酶消化质粒和外源ＤＮＡ。如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒ＤＮＡ。通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化ＤＮＡ，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。(２）按如下所述设立连接反应混合物：a．将0.1μl载体ＤＮＡ转移到无菌微量离心管中，加等摩尔量的外源ＤＮＡ。b．加水至7.5μl，于45℃加温５分钟以使重新退炎的粘端解链，将混合物冷却到０℃。c．加入 ...

1.仪器装置 电泳室及直流电源同纸电泳。 2.试剂 (1) 醋酸－锂盐缓冲液(pH3.0) 取冰醋酸50ml，加水800ml混合后，用氢氧化锂调节pH至3.0，再加水至1000ml。 (2) 甲苯胺蓝溶液 取甲苯胺蓝0.1g，加水100ml使溶解。 3.操作(1)制胶 取琼脂糖约0.2g，加水10ml，置水浴中加热使溶胀完全加温热的醋酸－锂盐缓冲液(pH3.0)10ml，混匀，趁热将胶液涂布于大小 ...

　　一般情况下，只要有克隆的探针，就不用寡核苷酸探针。在DNA序列未知而必须首先进行克隆以便绘制酶谱和测序时，也常应用克隆。克隆探针一般较寡核苷酸探针特异性强，复杂度也高，从统计学角度而言，较长的序列随机碰撞互补序列的机会较短序列少，克隆探针的另一优点是，可获得较强的杂交信号，因为克隆探针较寡核苷酸探针掺入的可检测标记基因更多。但是，较长的探针对于靶序列变异的识别能力又有所降低。对于仅是单个碱基或 ...

1.仪器装置 通常由稳流电泳仪和圆盘或平板电泳槽组成。其电泳室有上、下两槽每个槽中都有固定的铂电极，铂电极经隔离电线接于电泳仪稳流挡上。 2.试剂 (1)溶液A 取三羟甲基氨基甲烷36.6g，四甲基乙二胺0.23ml加0.1mol/L盐酸溶液48ml，再加水溶解并稀释至100ml置棕色瓶内，在冰箱中保存。 (2)溶液B 取丙烯酰胺30.0g、次甲基双丙烯酰胺0.74g，加水溶解并稀释至100ml滤 ...

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分子量是根据大多数蛋白都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的负电荷，消除了不同蛋白分子的电荷效应使蛋白分子相对迁移率(R')的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子量的标准蛋白的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分子量。 1.仪器装置 同聚丙烯酰胺凝胶电泳。 2.试剂 (1)丙烯 ...