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        质粒DNA的提取及鉴定

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        1617

          1.收获细菌

          (1)将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中,接入一单菌落,于37℃剧烈振荡培养过夜。
          (2)将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中,用台式离心机于4℃以12000g离心5min,将剩余的培养物贮存于4℃。
          (3)吸尽培养液,使细菌沉淀尽可能干燥。

          2.碱裂解法小量抽提质粒

          (1)将细菌沉淀[上述步骤(3)所得]重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ(50mmol/L葡萄糖,25mmol/l Tris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA)中,剧烈振荡。
          (2)加200μl新配制的溶液Ⅱ(0.2mol/l NaOH, 1%SDS),缓和振荡,水浴5min。
          (3)加150μl预冷溶液Ⅲ(50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml),缓和振荡,冰浴5min。
          (4)4℃以12000g离心5min,将上清转移到另一离心管中。
          (5)可作不可作:加等量饱和酚,氯仿,振荡混匀,重复2,(4)。
          (6)用2倍体积无水乙醇室温沉淀双链DNA,振荡混合,于室温放置2min。
          (7)4℃以12000g离心5min。
          (8)小心吸尽上清液,将离心管倒置于一张纸巾上,再将附于管壁的液滴除尽。
          (9)用75%乙醇于4℃洗涤DNA,同上离心去上清真空抽干。
          (10)加50μl的1×TE(含20μg/ml无DNA酶的胰RNA酶),振荡,贮存于-20℃。

         

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