化学生物学实验技术

1 萃取压力的影响 萃取压力是SFE最重要的参数之一，萃取温度一定时，压力增大，流体密度增大，溶剂强度增强，溶剂的溶解度就增大。对于不同的物质，其萃取压力有很大的不同。2 萃取温度的影响 温度对超临界流体溶解能力影响比较复杂，在一定压力下，升高温度被萃取物挥发性增加，这样就增加了被萃取物在超临界气相中的浓度，从而使萃取量增大；但另一方面，温度升高，超临界流体密度降低，从而使化学组分溶解度减小， ...

组织化学或细胞化学染色（histochemical or cytochemical staining）是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性或定位研究的技术。利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。 （一）、固定 目的是将细胞的结构和化学物质双重地保存下来，固定细胞的方法有： 1．物理固定 ...

为了满足实时PCR更高敏感性要求，各试剂公司都致力于开发新型的化学发光材料，目前作为商业用途的这些化学物质都能适用于上述的各种仪器。它们主要有以下几种：1. 水解探针或Taqman探针：这种探针用于Taqman分析法，它能被DNA合成酶(例如Taq酶)的5’à3’活性所降解，探针的5’端有一荧光报告基团，3’端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互先靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光 ...

固定收集斑马鱼的胚胎，在Holfretor水中培养，到达所需要的发育时期时，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小时后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后换成甲醇，在-20C 保存，待用(两天和两天以上的胚胎需要用双氧水处理，去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培养，可阻断色素的形成)一. 原位杂交第一天1. 重新水化和固定1） 吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5 ...

对PCR产物进行实时定量的测定之所以能成为现实，并且应用如此广泛，其中一个重要的原因就是新的热循环仪的研制与推广。目前，国内外常用的热循环仪主要有以下几种：1. PE公司生产的Applied Biosystem系列：(1) ABI　Prism 7700 Sequence Detection System (SDS)是第一种作为商业用途的实时PCR测定仪，它由激光激发荧光，并且可在500-660nm ...

实时定量PCR技术自1996年诞生以来，由于它显著的优越性，不仅广泛的应用于分子生物学的各个研究领域，而且也开始作为一种诊断手段应用于临床。其应用涉及到的范围包括DNA、mRNA和病毒荷载量的定量，核酸多态性分析，基因突变分析等多个领域。Giulietti 等人对用实时定量PCR测定细胞因子基因的表达作了详细的描述。细胞因子是一种调节蛋白，它对免疫反应、炎症反应具有重要的调节作用，其量的改变常常与 ...

实时定量PCR已广泛地运用于分子生物学的各个领域，就目前的应用情况来看，虽然取得了很好的效果，但是其在方法学上的选择、敏感性问题、重复性问题等都一直是争论不休的，本文将就这些问题做出探讨。1. 方法的选择：研究者在实验中往往想要得到目的基因的绝对量，因为绝对定量对目的基因的表达差异有直接的反映。绝对定量最为简单的方法就是标准曲线法，用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在同等条件下目的基因测得的荧 ...

由于各家公司生产的热循环仪提供的各种实验方案不太一致，所以优化的策略也不尽相同，然而在各种方案中，前文所述的那些影响实时PCR 反应的因素却总是相通的。只要能较好地控制实验条件，优化实验步骤，要想获得满意的实验结果并不一定都是困难的。下面本文将就影响到实验结果的一些基本参数和实验步骤谈一谈关于实时定量PCR的优化。1. 基本参数的优化：1.1　　　MgCl2的浓度　在PCR反应中，MgCl2的浓度 ...

一、核酸及蛋白质常用数据 1．核苷三磷酸的物理常数化合物 分子量 λmax(pH7.0) 1摩尔溶液（pH7.0）中λmax时的最大吸收值 OD280/OD260ATP 507 259 15400 0.15CTP 483 271 9000 0.97GTP 523 253 13700 0.66UTP 484 262 10000 0.38dATP 494 259 15200 0.15dCTP 467 ...

特异性强　PCR反应的特异性决定因素为：　　　①引物与模板DNA特异正确的结合；　　　②碱基配对原则；　　　③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；　　　④靶基因的特异性与保守性。　　其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加， ...

PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。　　琼脂糖凝胶电泳： 通常应用1～2%的琼脂 ...

聚合酶链反应技术简称PCR技术，是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片断高效扩增的技术，可检出微量靶序列（甚至少到1个拷贝）。在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。仅需用极少量模板，在一对引物介导下，在数小时 内可扩增至100万-200万份拷贝。PCR反应分三步：变性、退火及延伸。以上三步为一循环，每一循环的产物作为下一个的模板，这样经 ...

将某一特定的靶基因传递到靶细胞，需要应用某一基因运载系统，目前将这一系统概括为两大类：非病毒辣方法和病毒方法。1.基因转移的非病毒方法直接注射法 将含有DNA的溶液直接注射到肌肉，以引起邻近的细胞摄入DNA燕进行表达，在肌细胞中，基因表达可持续数月。磷酸钙共沉淀法 将氯化钙、DNA和磷酸盐缓冲液混合，形成磷酸钙微沉淀 ，附着于细胞膜并经过细胞内吞作用耐是入细胞质。该方法的转化效率通常很低。脂质体染 ...

基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reactionPCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测 ...

基因诊断又称DNA诊断或分子诊断，是通过从患者体内提取样本用基因检测方法来判断患者是否有基因异常或携带病原微生物。目前，基因诊断检测的疾病主要有三大类：感染性疾病的病原诊断、各种肿瘤的生物学特性的判断、遗传病的基因异常分析。在感染性疾病方面主要有结核病、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV），甚至艾滋病等。

在2月份出版的《自然—遗传学》上，Frank Holstege和同事报告了一种分析原发性肿瘤、预测其进展和扩散速度的方法，从而有助于提高对患者的诊断、治疗和治疗结果。 头劲部鳞状细胞癌(HNSCC)是人类所患的第五大恶性癌症，研究人员对这种疾病进行了研究。因为治疗方法主要依赖于癌症的进展程度，所以早期的诊断非常重要。而且，局部淋巴结转移的探测对治疗方案的选择来说尤为关键。前兆性的基因表达图 ...

　　该法又称粒子轰击(particle bombardment)，高速粒子喷射技术(High-velocity particle microprojection)或基因枪轰击技术(gene gun bombardment)，是由美国Comel大学生物化学系John.C.Santord等于1983年研究成功。并在1987年，Vlein首先报道了应用此技术将TMV（烟草花叶病毒）RNA吸附到钨粒表面， ...

　　 确定单链核酸碱基序列的技术。其基本原理是待测单链核酸与已知序列的单链核酸（叫做探针）间通过碱基配对形成可检出的双螺旋片段。这种技术可在DNA与DNA，RNA与RNA，或DNA与RNA之间进行，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同类型的杂交分子。作为探针的已知DNA或RNA片段一般为30～50核苷酸长，可用化学方法合成或者直接利用从特定细胞中提取的mRNA。探针必须预先标记 ...

科学家希望能利用新发现的小干涉RNA（“small interfering RNAs”）分子开发出新的疾病疗法，因为这种分子可以特异性地关闭目标基因的表达。但是，这种想法遇到了一个障碍，就是外界导入的RNA分子在体内会迅速被降解。 现在，由David Morrissey领导的研究小组发明了一种新的方法，即利用脂质双分子层，来保护RNA分子免受破坏。 他们将脂质双分子层包被、特异性针 ...

发表在4月出版的《自然—医学》上的两份报告显示，核糖核酸(RNA)干扰也许是治疗肌萎缩侧索硬化症(ALS)的一种有效方法。 ALS也称为格里克症，表现为脊柱神经的死亡所导致的肌肉消瘦和运动问题。遗传性ALS的发病原因是一种名为SOD1的蛋白质的基因发生了变异，经过基因工程携带上一个这种人类基因的小鼠出现了类似于ALS患者的症状。Patrick Aebischer和Scott Ralph领导的 ...