化学生物学实验技术

“嘧啶型”三螺旋或嘧啶-嘌呤-嘧啶（Y·RY）型三螺旋中，第三条嘧啶链以平行于Watson-Crick双螺旋中嘌呤链的方向，缠绕到双螺旋的大沟上；专一性地与嘌呤链结合。例如，典型的Y·RY型三螺旋T·AT和C ·GC，其专一性体现在T对AT，质子化的C对GC的识别。这些三螺旋的结构基本单位是三碱基体。T·AT和C ·GC三螺旋的链3和链2的碱基以两个Hoogsteen氢键配对，不影响链1和链2间的 ...

蛋白表达水平受许多不同因素和过程影响。蛋白稳定性、mRNA稳定性和翻译效率在蛋白生产和积累中起主要作用。翻译过程分为起始、延伸和终止三个期。对于翻译的起始，原核mRNA需要5'端非翻译前导序列中有一段叫Shine-Dalgarno序列的特异核糖体结合序列。在真核细胞，有效的起始依赖于围绕在起始密码子ATG上下游的一段叫Kozak序列的序列。密码子利用或偏爱对延伸有深刻的影响。例如，如果mRNA有很 ...

“嘌呤型”或嘌呤-嘌呤-嘧啶型（R·RY）三螺旋中，第三条嘌呤链以反平行于Watson-Crick双螺旋嘌呤链的方向缠绕到双螺旋的大沟上，专一性地与嘌呤链结合。例如，典型的R·RY型三螺旋G·GC和A·AT，其相应的结构单元三碱基体（图3-26）；其专一性体现在G对GC、A对AT的识别。 早期，在利用光谱学和超分离测量方法探索三链复合物时发现了G·GC和I·IC两种R·RY型三螺旋。后来 ...

分子内三链DNA是由一条单链通过自身回析形成的，其结构中含有两个loop环，为了满足形成过程中对极性以及碱基配对的要求，这条单链必须具有特殊的序列，即其序列要具有镜像重复性（mirror repeat），例如，对PyPuPy型三链，两条嘧啶链相对于中间的嘌呤链来说具有镜像对称的关系。由于分子内三链的各条链都位于同一分子内，所以与分子间三链相比，它更易于形成。

Lacks 1996年曾提出了一种三碱基体，其中第三条链上的碱基不仅与双螺旋嘌呤链上的碱基相互作用，同时也与第一条链上的嘧啶碱基相互作用。Zhurkin等在研究活体的基因重组时又提出了这种不同于Y·RY和R·RY型三螺旋的三链复合物。一般的基因重组是两条染色体通过断裂和连接机制来交换基因信息的。基因数据表明最初的相互作用可被看作是一种非对称链的交换过程，此过程仅涉及到期三条链。近年来的一些研究结果 ...

根据第三条链的来源，三链又可分为分子内和分子间两大类：分子内的三链DNA是由一条链通过自身回折形成的，分子间的又分为两种： ①由一条单链与发夹结构或环状单链所形成，②由一条单链与线状双链形成。但不论何种结构，三链中两条化学同源的链（Pu与Pu，Py与Py）都是反平行的定位。 分子间三链DNA由单链与发夹结构所形成的三链按形成发夹的序列又分为两种类型：①经典的发夹结构，形成发夹的两部分在序列上 ...

H-DNA又称铰链DNA，是三螺旋结构中较为特殊的一种，1987年由Mirkin等在一种持粒的酸性溶液中首次发现。H-DNA可在任何以镜象重复的寡聚核苷酸中产生（核苷酸序列具有H回文结构）。H-DNA的形成始于共聚物内部突环，其中的双链在一边轻微旋转，折叠回去，以生成第一个三股碱基对。这种成核过程建立了一种非平衡的H-DNA构型。缠绕与变性导致了其余DNA分子负超螺旋松弛。3′和5′一半的多聚嘧啶 ...

蛋白质组(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一个基因组(genOME)，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质(PROTein). 蛋白质组的概念与基因组的概念有许多差别，它随着组织、甚至环境状态的不同而改变. 在转录时，一个基因可以多种mRNA形式剪接，并且，同一蛋白可能以许多形式进行翻译后的修饰. 故一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物，蛋白质组中蛋白质的数目有时可以超 ...

β-折叠结构（β-sheet）又称为β-折叠片层（β-plated sheet）结构和β-结构等。这是Pauling和Corey继发现α-螺旋结构后在同年又发现的另一种蛋白质二级结构。β-折叠结构是一种肽链相当伸展的结构，多肽链呈扇面状折叠。β-折叠结构的形成一般需要两条或两条以上的肽段共同参与，即两条或多条几乎完全伸展的多肽链侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的氨基和羰基之间形成有规则的氢键，维持这 ...

β-转角结构（β-turn）又称为β-弯曲（β-bend）、β-回折（β-reverse turn）、发夹结构(hairpin structure)和U型转折等。蛋白质分子多肽链在形成空间构象的时候，经常会出现180°的回折（转折），回折处的结构就称为β-转角结构，一般由四个连续的氨基酸组成。在构成这种结构的四个氨基酸中，第一个氨基酸的羧基和第四个氨基酸的氨基之间形成氢键。甘氨酸和脯氨酸容易出现在 ...

结构域（structural domain）是介于二级和三级结构之间的另一种结构层次。所谓结构域是指蛋白质亚基结构中明显分开的紧密球状结构区域，又称为辖区。多肽链首先是在某些区域相邻的氨基酸残基形成有规则的二级结构，然后，又由相邻的二级结构片段集装在一起形成超二级结构，在此基础上多肽链折叠成近似于球状的三级结构。对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或多个在空间上可明显区分的、相对独立的区域 ...

需研究的基因称为目的基因，需分析的基因称靶基因，在基因克隆过程中有时两者均称为插入基因，有时三者含义相近。简单的原核生物目的基因可从细胞核中直接分离得到，但人类的基因分布在23对染色体上，较难从直接法得到。简短的目的基因可在了解一级结构或通过了解多肽链一级结构氨基酸编码的核苷酸序列基础上人工合成。但多数的目的基因由mRNA合成cDNA（complementary DNA，反转录DNA）得到。CDN ...

大肠杆菌DNA聚合酶（E.Coli DNA polymerase）主要有3种作用：①5’→3’的聚合作用。但不是复制染色体而是修补DNA，填补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。②3’→5’的外切酶活性。消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。③5’→3’外切酶活性。切除受损伤的DNA。它在切口平移（nick translation）中应用。　　大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是完整的 ...

　　反转录酶（Reverse transcripatase）是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。哺乳类C型病毒的反转录酶和鼠类B型病毒的反转录酶都是一条多肽链。鸟类RNA病毒的反转录酶则由两上亚基结构。真核生物中也都分离出具有不同结构的反转录酶。这种酶需要镁离子或锰离子作为辅助因子，当以mRNA为模板时，先合成单链DNA（ssDNA），再在反转录酶和DNA聚合酶Ⅰ作 ...

惰性多聚体可用来促进250个碱基以上的探针的杂交率。对单链探针可增加3倍，而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达100倍。而短探针不需用促进剂，因其复杂度低和分子量小，短探针本身的杂交率就高 。　　硫酸葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。这是一种多聚胺，平均分子量为500000。另一种常见的促进剂是聚乙二醇（PEG），PEG分子量小（6000～8000）、粘度低、价格低廉， ...

质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段 然后体外使两者相连接 再用所得到重组质粒转化细菌即可完成。但在实际工作中 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓 ...

　　七十年代巴斯德毕赤酵母曾被用于生产单细胞蛋白（SCP），有很好的发酵基础，菌体密度可达100g/L干重。其生长培养液的组分包括无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉价而无毒。它能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30％。而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。AOX的合成是在转录水平调控的。其基因启动子具有 ...

DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交 ...

蛋白质组(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一个基因组(genOME)，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质(PROTein). 蛋白质组的概念与基因组的概念有许多差别，它随着组织、甚至环境状态的不同而改变. 在转录时，一个基因可以多种mRNA形式剪接，并且，同一蛋白可能以许多形式进行翻译后的修饰. 故一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物，蛋白质组中蛋白质的数目有时可以超 ...

蛋白质组数据库(proteome database)被认为是蛋白质组知识的储存库，包含所有鉴定的蛋白质信息，如蛋白质的顺序、核苷酸顺序、2-D PAGE、3-D结构、翻译后的修饰、基因组及代谢数据库等. 例如，SWISS-2DPAGE数据库包括人类，细菌，细胞等物种的信息.其中，E.coliSWISS-2DPAGE数据库是EXPASY分子生物学服务器的一部分，通过www的URL网址http://w ...