细胞功能测定

ReagentsMedium:500 ml Dulbecco’s Modified Eagle Medium (Gibco #41966-029)55 ml FCS (10 %)2.8 ml Gentamycin Solution (Sigma G-1272 10 ml))TrypsinTrypsin (10x) lyophilised (Gibco 25095-019)SolutionVerse ...

Cell CultureMaterials1. Falcon Primaria culture dishes. 2. Culture medium: DME (or F12K) with glutamine supplemented with 7% heat-deactivated horse serum (56oC for 30 min) 7% fetal calf serum 50 units ...

IntroductionMature T cells recognize and respond to the antigen/MHC complex through their antigen-specific receptors (TCR). The most immediate consequence of TCR activation is the initiation of signal ...

美国科学家发现一种用处极大的细菌 　美国马萨诸塞州大学科学家2003年12月17日宣布，他们发现一种存在于泥土中的细菌能够帮助清理含放射性元素的废料，而且还可能用来发电，制成生物电池。 　科研人员发表在《科学》杂志上的文章说，这种具有异常功能的细菌名为减硫性土壤类细菌。通过破译与分析细菌的基因组，研究人员发现，这种细菌内的基因可使它们将很多不同的金属和放射性元素从地下水中沉淀出来 ...

美国科学家发现一种用处极大的细菌 　美国马萨诸塞州大学科学家2003年12月17日宣布，他们发现一种存在于泥土中的细菌能够帮助清理含放射性元素的废料，而且还可能用来发电，制成生物电池。 　科研人员发表在《科学》杂志上的文章说，这种具有异常功能的细菌名为减硫性土壤类细菌。通过破译与分析细菌的基因组，研究人员发现，这种细菌内的基因可使它们将很多不同的金属和放射性元素从地下水中沉淀出来 ...

冻存方法1．细胞：选对数生长期细胞，收集细胞24小时前换液一次。2．计数：按常规方法把细胞制成细胞悬液，计数，令细胞密度达5×106/ml，离心去上清，吸入离心管中。3．冻存液：先用培养液9分＋DMSO 1分（或甘油）配成10％的DMSO冻存液，按上法一滴滴加入离心管中，然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬。4．分装：分装入无菌安剖中，每安剖加1.5毫升细胞悬液。5．封口：用塑料安剖时拧紧瓶口即可；如用火 ...

复苏方法1．从液氮罐中取出安剖；有时因安剖未封严，浸入了液氮，取出后因安剖内液氮迅速气化而发生爆炸，因此应带有防护眼睛和手套。2．迅速放入盛有36℃～37℃水的搪瓷罐中，扣上盖并不时摇动，尽快解冻。3．剪开纱布口袋，取出安剖，用70％酒精擦拭消毒后，净化台上打开盖，用吸管吸出细胞悬液，装入离心管中，再补加10ml培养液，吹打使细胞悬浮。4．低速离心（500～1000转/分）5分钟，取上清后再重复用 ...

上皮细胞培养1）表皮细胞培养1．取材：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳，早产流产儿皮肤更好，切成0.5～1平方厘米小块。2．EDTA处理：先置入0.02％EDTA中室温置5分钟。3．冷消化：换入0.25％胰蛋白酶中，置4℃过夜。4．分离：取出皮肤，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开。5．温消化：取出表皮单独处理，用剪刀剪成更小的块后，置入新的0.25％胰蛋白酶中，37℃再消化30～60 ...

染色体结构显示和检测1） 染色体显带显Q带法1. 漂洗：取经过干热预处理或已老化的染色体标本，置于pH6.0缓冲液中浸5~10分钟。2. 染色：浸入pH6.0的GM或QD染液中5~10分钟。 3. 漂洗：浸入新鲜pH6.0缓冲液中漂洗两次，每次5分钟。4. 观察：向标本染色体面滴1~2滴新鲜缓冲液，覆以盖片（避免出气泡），置荧光显微镜下观察。显G带法胰酶 ...

DNA（基因）检测－Southern BlotDNA吸印转移1．室温下将电泳后的琼脂糖凝胶浸入500ml溶液A中，摇动30分钟后换500ml新鲜溶液A再摇30分钟，使DNA双链碱变性。溶液A：5M NaCl 300.0ml10M NaOH 50.0mlH2O 650.0ml2．为使凝胶重新回到中性，换入溶液B中重复上述1过程。溶液B：10M 乙酸铵 200. ...

蛋白质检测－Western Blot1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。4）将上述装置放入缓冲液槽 ...

基因性状的其它检测方法1） 基因长度多态性（RFLP）检测在无DNA缺失，仅发生核苷酸改变性突变疾病时，往往出现酶切位点发生改变，通过RFLP分析可以显示出。设计一对适当引物，使被扩增的片段包含有某一个或数个多态性的限制性内切酶识别位点的序列。进行PCR后，用限制性内切酶酶切PCR产物；理论上两个DNA样品序列完全相同时，同一酶切的片段也应是一样的，如一个发生变异，电泳后反应在酶切片段长度上会有 ...

酵母DNA分离1）酵母DNA微量制备（40ml）1．在125ml三角瓶中用40ml YPD培养液在30℃条件下培养细胞达最大生长量（过夜）。2．将上述培养物移入螺盖离心管，用医用离心机或Sorvall SS－34转头以5000r/min离心5分钟，弃去上清液。3．将细胞悬浮在3ml的0.9mol/L山梨醇－0.1mol/L Na2EDTA(pH7.5)溶液中。4．加0.1ml的2.5mg/ml消解 ...

酵母蛋白质的抽提此法抽提的酵母蛋白适用于SDS凝胶电泳和Western印迹分析。1．从OD600＝2的细胞培养物中抽提酵母蛋白质。培养物的一种简单制备方法是将细胞接种到5ml YPD中，过夜培养后获得指数培养物（OD600＝0.5～2.0）。2．在水浴上把OD600＝2的细胞培养物转到含有2ml的50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、10mmol/L叠氮化钠溶液的13mm离心管中，用吊 ...

质粒DNA的羟基突变1．临用之前制备羟胺溶液，置冰上待用。2．将用氯化铯纯化的10μg质粒DNA加到含500μl羟胺溶液的微型离心管。3．在37℃下培养20小时。4．加入10μl的5mol/L NaCl、50μg 1mg/ml的牛血清蛋白（BSA）和1ml无水乙醇终止反应，置－70℃沉淀DNA10分钟。5．离心10分钟，小心弃去所有上清液，收集DNA。6．将DNA悬浮于100μl TE缓冲液（pH ...

酵母β－半乳糖苷酶的测定1） 粗提取物测定1．在适当温度下（通常30℃），用适当培养液将5ml细胞培养物培养到浓度为1×107～2×107细胞/ml。如果自主复制质粒的杂合基因表达，可使用一种适当培养基对存在质粒的菌株进行筛选。2．在冰上冷却细胞，离心收集。注意：以下步骤保持细胞在冰上。3．弃上清液，将细胞悬浮于250μl裂解缓冲液中，然后置－20℃冻结，以备的第二天测定。以下步骤均在1.5ml ...

羧肽酶Y的平板鉴定1．在YPD平板上培养菌落和菌苔（通常菌落长3天，菌苔长1天即可）。2．小心把涂盖液加在平板的表面使之完全覆盖细胞。3．待琼脂凝固5～10分钟后，小心用新鲜Fast Garnet GBC溶液冲刷表面。4．显色5分钟，野生型菌株将变红，而羧肽酶Y－菌株将呈现黄色或粉红色。5．倒出Fast Garnet溶液以便更好观察颜色变化。 ...

酵母免疫荧光1）细胞制备1．培养5ml酵母至对数生长早期（106～107细胞/ml）。2．直接加1/10体积的甲醛到培养基里固定细胞（加入的甲醛终浓度为3.7％，标准母液是37％）。3．细胞在甲醛中培养至少1小时。4．离心收集细胞，用0.1mol/L磷酸钾（pH7.5）洗一次。5．把细胞悬浮在1ml的50mg/ml消解酶100T或50单位/ml的溶细胞酶溶于含有2ml/ml 6-巯基乙醇的0.1m ...

固定化细胞的肌动蛋白染色1．培养细胞到对数生长期（约107细胞/ml）。2．直接取0.1ml甲醛加到含有1ml培养物的离心管中固定细胞（甲醛浓度为3.7％；标准母液是37％）。3．在甲醛中培养细胞30分钟或稍长时间。4．用PBS洗两次，离心5分钟收集细胞。5．用50μl的PBS悬浮细胞，加5个单位的罗丹明或荧光素连接的鬼笔环肽。6．用PBS洗3次，重新悬浮在小体积的封固剂中。7．用罗丹明或荧光素滤 ...

PCR介导基因破坏法1．反应混合物：5μl 10×Taq缓冲液5μl 25mmol/L MgCl22μl 10mmol/L dNTPs10~100ng 模板DNA25pmols 引物（每种引物）0.5μl Taq DNA聚合酶（2U