蛋白相互作用技术

作者：王旭 何冰芳 李霜 韦萍 欧阳平凯(南京工业大学制药与生命科学学院江苏南京　210009)常规Tris-甘氨酸-SDS-PAGE 电泳分析分辨大分子物质的相对分子质量范围在10～200 kDa 对于相对分子质量小于10 kDa 的多肽分辨率低 。Swank 等在含有SDS 的凝胶中加入8 mol·L-1的脲但分离效果不甚理想 且重现性较差。Lanzillo 等发现在Laemmli 系统和仅 ...

Downstream（下游）与上游相对的概念，一般而言，上游指基因克隆、细胞培养等目的产物表达工序，下游指从表达有目的产物的复杂的混合液中分离纯化得到符合要求的目的产物的一系列步骤。美、日、欧等发达国家生物技术产品工业化的实践证明：生物技术产品的产业化高度依赖于基因工程下游工序技术及设备的进步。一、纯化工艺常用衔接技术：1、盐析。常采用硫酸铵、硫酸钠盐析，获得的盐析沉淀物在低温冰箱(2、等电点沉淀 ...

目的要求(1) 学习葡聚糖凝胶过滤法测定蛋白质的分子量的原理(2) 掌握葡聚糖凝胶过滤法测定蛋白质的分子量的操作技术。实验原理葡聚糖凝胶（Sephadex）过滤法测定蛋白质分子量的原理，主要是依据这种凝胶具有分子筛作用，一定型号的凝胶具有大体上一定大小的孔径。在一定的凝胶柱内，凝胶孔隙所占的体积称为内水容积Vi，凝胶颗粒间的自由空间所占的体积称为外水容积V0。当样品流经凝胶柱时，大于孔隙的大分子完 ...

染色质免疫共沉淀技术（ChIP）　　真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay CHIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内 ...

检查试管是否干燥、洁净，若否，则将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。1.标准曲线的制作 取普通清洁试管7支，标号，1号管为空白，2～7管用微量注射器分别加1.0mg/mL的牛血清白蛋白（即标准蛋白质）溶液10，20，40，60，80，100mL。各管均用0.015mol/L PBS缓冲液补充到100mL（即0.1mL），详见表6-1。混匀待用。表13-1标准曲线的制作 ...

目的要求 学会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理。 掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量的操作技术。实验原理:SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4g SDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SD ...

一、原理LoWry法是双缩脲法（BIureT）和福林酚法（FolIn-酚）的结合与发展。其原理是蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜—蛋白质的络合盐。再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸（PHosPHoMolyBdATe & PHosPHoTungsTATe），使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的 ...

实验三、蛋白质的盐析透析一、 蛋白质盐析（一）目的要求 了解蛋白质的沉淀作用，加深对影响蛋白质胶体分子稳定性因素的认识。（二）实验原理水溶液中蛋白质分子由于表面生成水化层及蛋白质分子上某些基团离子化而使蛋白质分子表面带有电荷，增加了水化层的厚度而成为稳定的亲水胶体颗粒，水膜和电荷一旦被除去，蛋白质颗粒将由于失去电荷和脱水而发生沉淀。向蛋白质溶液中加入无机盐（如硫酸铵、硫酸镁、氯化钠等）后，蛋白质便 ...

在蛋白质的提纯方法中，选择性吸附也是应用历史较久迄今仍在广泛采用的方法之一。早期工作常用高岭土（我国的一种土质，其分子式大致是AL2O3·2SiO2·2H2O）、氧化铝（AL2O3）及活性炭等吸附剂，由于这些吸附剂吸附力较弱，或者易引起蛋白质变性而应用不广，现已为凝胶性吸附剂所代替，如氢氧化铝凝胶和磷酸钙凝胶，尤其后者使用最广。吸附剂的应用有两种不同方式。当蛋白质较易吸附时，可以选择适当条件主要吸 ...

氮素代谢在植物的新陈代谢中占主导地位。植物组织中有机氮化物的含量随着植物的生理状况及环境条件的不同而发生变化。所以测定其含量，对研究植物的氮素吸收、运输和代谢规律，以及确定农产品的品质、营养价值等具有一定意义。一、原理植物组织中的有机氮化物包括蛋白氮和非蛋白氮。非蛋白氮主要是氨基酸和酰胺，以及少量无机氮化物，是可溶于三氯乙酸溶液的小分子。可加入三氯乙酸，使其最终浓度为5％，将蛋白质沉淀出来，分别测 ...

一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10 ...

纤维连接蛋白(fibronectin，Fn)是一组高分子糖蛋白，广泛存在于细胞表面、细胞外液及结缔组织有关的基底膜上。Fn具有促进细胞粘连，细胞与纤维、基质间的连接；促进巨噬细胞的吞噬功能等广泛生物学活性；并与机体创伤组织愈合、组织炎症、纤维化及硬化过程等密切相关。因此，Fn的含量变化与临床多种疾病的严重程度和转归密切相关。检测Fn的方法常用单向免疫扩散法、胶乳凝集法、间接血凝法、激光免疫比浊法以 ...

GFP在大肠杆菌中的诱导表达和细菌蛋白的超声破碎抽提【实验原理】把含有外源基因的表达载体转化的大肠杆菌在有相应抗菌素和诱导物的条件下培养，可以诱导外源蛋白在大肠杆菌中表达。利用溶菌酶、反复冻融或超声波破碎的方 法将诱导培养的细菌的细胞壁破碎后，可使那些可溶性的外源蛋白释放出来，再利用硫酸铵沉淀、蛋白质层析技术和制备电泳等方法能够将外源蛋白分离纯化出来， 供进一步的研究使用。有些过量表达的外源蛋白往 ...

　　1). 电泳中，只有在恒压的条件下电泳期间蛋白质才可以保持恒定的迁移速率。2). 电泳时出现不规则的迁移条带的原因多是电流不稳定。因此，要确保上下电泳槽中的电泳液与凝胶保持良好的接触。其他可能的原因包括：加样孔中加入的样品太多；样品中盐浓度太高；边缘效应。在凝胶边缘，迁移条带出现“微笑”状或样品迁移速度减慢，可能是因为凝胶的中间比两侧更热造成的，降低电压有助于改善这种情况。3). 染色和脱色一 ...

Biuret法测定蛋白质含量逐渐隐退的原因分析 　　蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。蛋白质的测定在 不断的更新以及替换，但是不论时代如何的进步，蛋白质测定仪就有四种较为经典的检测 方法，凯氏定氮法（可以直接使用自动型凯氏定氮仪来进行替代），双缩尿法（Biuret法 ）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。这四种方法是即经典又传统的检测方法 ，四种方法中 ...

　　银染注意事项:1. 银染主要出现在胶的表面，用薄胶（0.5-0.75mm）可以提高灵敏度。2. 对于考马斯亮蓝染色的胶，可用甲醇将胶漂洗后，继续进行银染。乙酸会干扰银染，因此要确保将凝胶中的乙酸彻底洗净。如果凝胶被过度银染，可用Rapid Fix脱色，并用考马斯亮蓝二次染色。3. 不同蛋白质对银染的反应是不一样的，尤其是碱性蛋白染色效果差。因此，不宜用银染测定不同蛋白的比例。4. 染色过程中， ...

一、根据蛋白质溶解度不同的分离方法1、蛋白质的盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等 ...

首先，摆摆自己的经验。鄙人做WB有8、9年了，平均下来两天跑一张多的蛋白胶；文章嘛，凑数的单篇有上24+，一作单篇15+（系国内完成；注：当年的IF，现在逐年递减没个标准）。其次，由于一些机缘的因素，在实验室WB体系完善的过程中，很多靠自己摸索；说实话，碰了一鼻子灰，差不多能碰到的问题都经历了，因此我敢写这样一个咚咚给大家分享。再次，我再强调一点，对我们这类人来说，实验结果的可靠、漂亮已经不算一个 ...

1. *纤维素膜纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有很强的结合能力，而且适用于各种显色方法，包括同位素，化学发光(Luminol类)、常规显色、染色和荧光显色；背景低，信噪比高。NC膜的使用也很简便，比如不需要甲醛预处理，只要在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了；比如NC膜很容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条件。转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保 ...

文转载于丁香园站友dlzhangyu的论坛大作，点此查看详情，感谢dlzhangyu站友的分享。 2011年鄙人做western的时候，发现目前的资料都很老，网上的资料也大多互相传抄，说法各异，于是综合了目前网上所能找到的资料和个人实际经验，编辑了这份western blot操作步骤2012版，内容包括主要操作步骤和所需要注意的有用的细节，并附上参考文献（原谅我无法像Endnote那样一一注明文 ...