蛋白相互作用技术

我想表达遇到的第一个瓶颈估计就是为什么我的外源片段插到载体里面，PCR鉴定没问题，双酶切也OK，可是就是不见表达。一般我们是如何判断没有表达呢？大多都是首先进行SDS-PAGE。在跑胶的时候一定要设对照，比较严谨的电泳对照，应该是：Marker，标准品阳性对照（如果有，且打算做Western的话），以及空白载体（诱导）和重组载体（不诱导）2个阴性对照，再加上诱导不同时间的表达结果。Marker用于判断条带大小，标准品用 ...

人们合成与生物相关的物质是从尿素开始的，1828年，德国化学家维勒人工合成了存在于生物体的这种有机物。在1960年我国科学家采用化学方法首次成功地合成了具有生物活性的蛋白质――胰岛素。随着内切酶的发现和基因工程技术的发展，人们发现用各种不同的载体在原核、真核系统中进行蛋白表达更为行之有效。而这其中大肠杆菌表达系统发展得最为迅速、成熟。原核表达具有操作方便、快捷，需时较短，表达量大，适合工业化生产等优点。虽然也有缺 ...

之所以首先介绍Novagen公司的产品是因为用过它的pET系列载体，感觉很好用。Novagen的母公司是德国默克（Merck）公司，它是国际著名的化学及制药公司总部位于德国的Darmstadt，已有300多年的历史。已在全世界55个主要国家设立了分公司，其中在28个国家建有62个生产基地。 Novagen公司出品的pET系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。p ...

Clontech公司最新推出的Living Colors Fluorescent Timer，是唯一一种能随着时间的延长而由绿色变为红色的的荧光蛋白报告基因。这种颜色可变的荧光蛋白为实时研究启动子的调控时效提供了可能：在活细胞或者活的生物体内，你不但可以看到某个启动子什么时候、在什么位置开始启动基因的表达，还可以观察到它什么时候关闭表达――这在以前是不可能实现的――而且由于这种报告基因是荧光蛋白，这种监测可以直接进行而 ...

METHOD for Western Blots:While your SDS-PAGE gel is running, make your transfer buffer and chill to 4°C. Check that you have a frozen buffer dam is ready (stored in freezer next to Shikha, top shelf to the right side--looks like rectangular white plastic cup --should be full of ice). Precut 3MM filter paper to s ...

Protocol for Protein Extraction10 % w/v TCA/ acetone/ 0.07 % v/v -MercaptoethanolPlant cells are rich in compounds that interfere with the 2DE separation method such as salts, organic acids, phenolics, pigments, terpenes, among others. A common protocol used in our lab for extraction protei ...

Immunoprecipitation and Immune Complex kinase assay--according to Tamara Hurley1) In the cold room, wash cells with cold "Tris" (the same stuff used for TC).Spin down the cells if you are working with suspension cells in a low speed swinging bucket centrifuge, resuspend in approximately 1 ml Tris ...

GPI蛋白本文提供了有关糖基磷脂酰肌醇（GPI，是许多蛋白以及�病毒蛋白结合于膜上的锚点）的信息。同时，网站还提供了许多相关链接和资源。GPI overviewGPI proteins in chickensGPI proteins in DrosophilaGPI in prion proteins Human GPI proteins: protectin (CD59) and homologous restriction factor (HRF, C8bp, MIP) GPI proteins in ye ...

The human and bovine 14-3-3 eta protein mRNAs are highly conservedEvolutionary conservation of the 14-3-3 proteinExpression and structural analysis of 14-3-3 proteinsCrystal structure of the zeta isoform of the 14-3-3 proteinStructure of a 14-3-3 protein and multiple signalling pa ...

糖类介绍--糖文库糖在体内的高聚物中, 糖是最后一个待发掘的领域. 糖与脂肪和蛋白质并列为三大营养物, 但是蛋白质构成酶和骨骼结构, 脂肪构成细胞膜, 而糖并没有吸引太多的关注. 由于其分子式(CH2O)n使得它看起来像是用碳和水做成的.我们容易注意到它的名字来自"碳的水和(carbohydrate)". 糖的结构被发现之前己经有一些混合碳和水以合成糖的尝试. 葡萄糖, 糖的基本元素之一, 被推测是由光合作用合成然后以糖原或淀粉形式储存. 然而, 最近发现构成细胞 ...

GST融合蛋白纯化方法 1目的片段接入pGEX载体； 2 涂板，挑单克隆，摇菌至OD600≈1.0，加入IPTG（终浓度1 mM）诱导6－8 h； 3 收菌，每升菌液约以50 mL PBS重悬，加入1%Triton X-100（v/v），1％β-巯基乙醇（v/v），PMSF（终浓度1 mM）； 以下步骤均在冰上操作： 4 超声破碎菌体，15000 g，10min离心取上清，在上清中加入适量GST-beads，轻轻晃动令其吸附蛋白1 h； 5 2000 g，3min离心弃上清； 6 加入至少10倍体积PBS，轻摇至b ...

选择材料及预处理　　以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场 ...

根据问题的类型主要分成以下几类：1. 谨言以下资料权作参考，请勿盲目模仿2. 针对样品的常见问题B. 做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot （以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？解答：怀疑 ...

蛋白质沉淀的概念：蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀(precipitation)，变性蛋白质一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质沉淀，在一定条件下，变性的蛋白质也可不发生沉淀。定性分析：蛋白质所形成的亲水胶体颗粒具有两种稳定因素，即颗粒表面的水化层和电荷。若无外加条件，不致互相凝集。然而除掉这两个稳定因素(如调节溶液pH至等电点和加入脱水剂)蛋白质便容易凝集析出。如将蛋白质溶液pH调 ...

1 蛋白质含量测定法2 WESTERN PROTOCOL3 Western免疫印迹（Western Blot）4 蛋白质沉淀法5 蛋白质提取的方法总汇 1 蛋白质含量测定法本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚 ...

一 caspase家族蛋白酶的组成未活化的caspase家族蛋白酶是以酶原形式存在的，酶原的氨基端有一段被称为“原结构域”(pro-domain)的序列。酶原活化时不但要将原结构域切除，并且要将剩余部分剪切成一大一小两个亚基，分别称为P20和P10，活性酶就是由这两种亚基以(P20/P10)2的形式组成的。这种活化反应也是Asp特异的，剪切发生在酶原中保守序列的Asp与其后的氨基酸残基之间，一般是 ...

简介以收集的蛋白质三维结构公共数据为核心，附带核酸、糖类三维结构和各类由 X 射线衍射结晶学家、核磁共振谱分析学家通过实验测定的合成物。http://www.pdb.org/pdb/home/home.do数据年增长概况rcsb-protein-data记录格式PDB 记录包括两个序列信息备份：隐性序列和显性序列。两者都被用于重构生物高聚体的化学图像。显性序列在 PDB 文件中以关键词 SEQRE ...

在大肠杆菌中，当外源蛋白高水平表达的时候，极易形成包涵体，为蛋白纯化等下游工作带来很大的麻烦。下面是一些可以参考的有助于提高目的蛋白可溶性表达的实验方案：1.降低蛋白合成的速度。可以通过以下方法实现：a.降低培养温度b.使用弱启动子c.使用低拷贝数的质粒表达载体d.降低诱导物的浓度2.改变培养基。a.培养基中加入可以帮助蛋白折叠的因子b.加入缓冲液保持pH稳定c.加入1%的葡萄糖，抑制lac启动子 ...

目的研究SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）显示小分子多肽的方法.方法　观察不同方法处理的样品，上样量对电泳结果的影响及对分子量标准（Mr2512～16949）进行直线回归分析.结果　样品的不同处理条件未见有差异；在该实验系统条件下上样样品为每孔5～10μg较佳；分子量标准直线回归系数r=-0.962.结论　样品处理方便；上样量少；在160 g?L-1 T，60 g?kg-1 C较 ...

DNA电泳一般使用的都是琼脂糖凝胶电泳，电泳的驱动力靠DNA骨架本身的负电荷。蛋白质电泳（一般指SDS-PAGE）一般使用的都是聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳的驱动力靠与蛋白质结合的SDS上所携带的负电荷。所以相同点就是样品都是带负电荷的，从负极向正极移动，移动的距离都和样品的分子量有关。而且这两个电泳体系可以互相交换使用。进行大分子蛋白质电泳时，可以考虑换用琼脂糖凝胶，因为该体系孔径大。相反，如果需要 ...