免疫共沉淀（co-IP）

本方法免疫沉淀得到的天然蛋白可用于 western 免疫印迹或是激酶活性分析所需溶液和试剂注意：所有溶液用反渗透去离子水（Reverse Osmosis Deionized water, RODI）或相当纯度的水配制。1. 20 X 磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）: (#9808) 配制 1L 1 X PBS 时，取 50 ml 20 X PBS 用 950 ml RODI 水稀释到 1L，混匀。2. 10 X 细胞裂解液: (#9803) 配制 1 L 1 X 细胞裂解液时，取 100 ml 细胞裂解液加 950 ml RODI 水稀释到 1L，混匀。注意：使用前添加 1 mM PMSF。3. 蓝色上样缓冲液（S ...

免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。当蛋白质处于正常天然构象时, 某些抗体所识别的表位未能暴露出来, 这种情况下需要采取下列方法进行变性蛋白的免疫沉淀。所需溶液和试剂注意：所有溶液均需要用 Milli-Q 超纯水或是相当纯度的其他水配制。1. 变性细胞裂解液：50 mM Tris (pH 7.5), 70 mM β ...

小鼠XX细胞药物干预后两种蛋白的磷酸化酪氨酸水平检测 实验分组：小鼠XX细胞，按下面分组进行药物干预培养，并收集细胞进行免疫沉淀实验。 1正常对照组2高糖组3高糖+E药物4高糖+A药物(25μM)5高糖+A药物(50μM)6高糖+A药物(100μM)7高糖+A药物(100μM)+B药物（1mM）8高糖+C药物(25μM)9高糖+C药物(50μM)10高糖+C药物(100μM)11高糖+C药物(100μM)+B药物（1mM）12高糖+D药物( ...

背景：真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。与传统的EMSA技术相比，染色质免疫沉淀技术（CHIP）能真实完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的最佳方法。原理：是在活细胞状态下以甲醛固定蛋白质－DNA复合物，超声将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后加入目的蛋白抗体，通过抗体沉 ...

完成《WB实战指南》后，朋友曾央分享点免疫共沉淀方面的咚咚；当时不得不回绝。因为，WB指南是基于这些年的回复的汇总，基本上方方面面的问题都有提及，只需要做些串联；而论及coIP，目前在国内还不太普及，尽管它已经是生化领域最基本的技术之一。因此，再想写这么个长篇颇耗时间，于我的时间和精力太为难；不过，今天是个特殊的日子，凑凑热闹吧。——人，如果在某些方面成功了，必然在另外一面有亏欠，也许这就是上帝的公允吧。——在自己最擅长的 ...

最近我们实验室想做这个试验，以前也没有做过，如果有战友做过这个试验，希望介绍点经验和教训，谢谢乐。应战友要求，在网上找乐一下基础资料，方便大家查看，虽然下面也列出了试验方法，但在实际实验室可能并不一样，希望战友们较少些自己的亲身体会，让大家和我本人在即将进行的试验中少走弯路。先谢谢各位了免疫共沉淀　　免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用 ...

论坛里发的都是关于细胞的免疫共沉淀的实验方法,这是我做组织时用到的方法,希望能给大家有点帮助实验方法如下:第一步：制备组织裂解物1. 把组织剪切成细小的碎片。2. 融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。3. 按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当 ...

在网上见到的一篇关于免疫沉淀的文献，较详细，现译之共享:免疫沉淀材料1，蛋白A 或蛋白G2，一抗3，免疫沉淀缓冲液：20 mM 磷酸钠, pH 7.5, 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP40, 0.5% 脱氧胆酸钠 and 0.02% 叠氮化钠.（ NOTE: 50 mM 醋酸钠缓冲液, pH 5.0,. 500 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% NP-40 and 0.02%叠氮化钠 也可作为免疫沉淀的缓冲液，能提高蛋白G的结合功效）4，洗脱液：0.1 M 甘氨酸-HCl buffer, pH 2.55，SDS-PAGE 上样缓冲液 (pH 6.8)： 2% SDS, 62.5 mM Tris 碱, ...

Methods2.1. Material and reagentsDuolbecco’s phosphate buffered saline (PBS), Medium 199 with Earle’s salts and 25mM HEPES, collagenase Type II (from Clostridum histolyticum), antibiotic/antimyotic solutuion (containing 10,000U penicillin, 10,000µg streptomycin, 25 ...

ChIP是一项比较流行的研究转录因子（ transcription factor TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。 ...

火箭电泳实际是一种定量免疫电泳。其原理为：在电场作用下，抗原在含定量抗体的琼脂介质中泳动，二者比例在合适时在较短时间内形成状似火箭或锥形的沉淀线，而此沉淀线的高度常与抗原量成正比关系，因此本法可以测定样品中抗原的含量。 一、材料 1. 诊断血清（抗体）：抗人IgG或IgA免疫血清。 2. 待检血清（抗原）：人血清。 3. 参考血清。 4. &nb ...

免疫电泳实验是先将抗原物质在琼脂凝胶中做电泳分离，然后于凝胶槽中加入抗体血清。使抗原抗体进行双向扩散，在比例适宜部位形成特异的抗原抗体沉淀弧线。 每条沉淀弧线代表一组抗原抗体复合物，故可用抗原成分分析；且可以根据其迁移率与抗体所出现的特异反应进行鉴定。 一、材料 1. 待检标本（抗原）：正常人血清。 2. 抗体：正常人血清的家兔免疫血清。 3. 1.5%离 ...

对流免疫电泳是在琼脂扩散基础上结合电泳技术而建立的一种简便而快速的方法。此方法能在短时间内出现结果，故可用于快速诊断，敏感性比双向扩散技术高10-15倍。 血清蛋白在pH8.6条件下带负电荷，所以在电场作用下都向E极移动。但由于抗体分子在这样的PH条件下只带微弱的负电荷，而且它的分子量又较大（为r球蛋白）。所以游动慢。更重要的是抗体分子受电渗作用影响较大，也就是说点渗作用大于它本身的迁移率。所 ...

琼脂扩散是抗原抗体在凝胶中所呈现的一种沉淀反应。抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相遇时，便出现可见的白色沉淀线。这种沉淀线是一组抗原抗体的特异性复合物。 如果凝胶中有多种不同抗原抗体存在时，便依各自扩散速度的差异，在适当部位形成独立的沉淀线，因此广泛地用于抗原成分的分析。琼脂扩散实验可根据抗原抗体反应的方式和特性分为单向免疫扩散、双向免疫扩散、免疫电泳、对流免疫电泳、单向及双向火箭电泳实验。 一 ...

当抗原与相应抗体形成一个接触面时，如二者比例适当，接触面上可形成一个乳白色的环状物即为阳性沉淀反应。 一、材料 （1）免疫血清：免疫兔抗人血清。 （2）抗原：人血清。 （3）小沉淀管、毛细吸管、橡皮头、生理盐水。 二、方法 （1）取小沉淀管2只，以毛细吸管吸取抗人血清约0.2ml，加入第一管，加时注意不能有气泡。 （2）以毛细吸管吸取生理盐水0.2 ml 加入第二管。 ...

一、IP前的准备工作： coIP：分为内源性蛋白的相互作用和非内源性蛋白相互作用（后者包括外源蛋白之间以及外源拖内源蛋白）。 非内源性蛋白的相互作用，主要是通过过表达来实现，通常为简化实验、提高IP效率会让外源蛋白带上标签（tagged；这也是没有相应的可用于IP的内源蛋白抗体之前唯一可行的方案），因此就tag的使用而言存在很多小技巧。 1. His-tagged主要 ...

在从事细胞信号转导的研究过程中我们常常需要探寻新的通路。在纵横交错，纷繁复杂的cross-talk中如何筛选可能的路径是signal transduction领域永恒的话题，而免疫共沉淀技术则是常用而简便的方法之一。 1. 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）技术是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。它能确定两种蛋 ...

注意的问题： （1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100）。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2%SDS），细胞裂解液中要加各种酶抑制剂。 （2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用。 （3）使用对照抗体： 单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗 兔多克隆抗体：正 ...

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其基本原理是：细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。 但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可 ...

IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体（免疫球蛋白）的FC片段的现象开发出来的方法。目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。 ...