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相关专题 本文主要介绍了利用Southern印迹杂交技术来获得DNA分子中基因编码区的大小和位置的实验原理、方法步骤。主要分成待测核酸样品的制备和 琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA样品两部分。 Southern印迹杂交仪器 实验原理 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的 ...

相关专题 本文介绍了分子杂交的基本概念及原理，其中主要是从DNA的变性和复性两方面来讲解分子杂交实验的原理。 核酸分子杂交 主要内容： 一、分子杂交的概念 二、分子杂交基本原理 (一)DNA变性： 1、DNA变性的方法 2、增色效应 3、溶解曲线 4、融解温度 5、影响Tm值的因素。 (二)复性：退火 一、分子杂交的概念： 分子杂交 ...

相关专题 本文主要简单阐述了Southern杂交、Northern杂交、原位杂交、点杂交这几种核酸杂交方法的异同点。并介绍了点杂交的基本概念及实验原理、方法。 几种核酸杂交技术的比较 点杂交实验原理、步骤 （1）几种核酸杂交的异同点 核酸杂交是分子生物学的基本技术，也是遗传学研究和基因诊断的常用方法。核酸杂交的形式有多种，其中最常 ...

相关专题 印迹(blotting)是生物学实验中常用的检测和分析方法。印迹(blotting)实验的过程可以简单描述为将待检测的生物大分子经电泳等方法分离后转移并固定在膜(如：硝酸纤维素膜、PVDF膜、尼龙膜)上，然后用特异性识别物质(如探针)去识别，最后经显色反应(同位素放射自显影、荧光、化学发光等)在膜上显示出结果------印迹。 最 ...

相关专题 Western Blot技术专题 1.制胶及上样： (1)配制12%SDS-PAGE分离胶，混匀后注入边条厚度为2mm的两块洁净玻璃板间，其上加一薄层异丙醇，室温下静置至凝固。 (2)待分离胶完全聚合后，倾去其上的水层，以吸水纸吸净残余液体，插入加样梳，缓缓加入浓缩胶，使其充满加样梳间的空隙，室温下静置。待胶完全聚合。 ...

相关专题 Western Blot技术专题LOWRY法蛋白定量专题 A. Folin-phenol(lowry method)定量法 此法以Biuret方法反应为基础发展而起，因此会严重干扰Biuret测定方法的因子都会影响此测定法的准确度。这些干扰因子包括：含-CS-NH2，-CH2-NH2，-CRH-NH2，-CH2-NH-CHNH2-C ...

相关专题 Western杂交时，为确认蛋白是否转至PVDF膜上，可用下列方法对膜上蛋白进行可逆性染色。 1. 氨基黑染色 染液：0.5% Amido Black (w/v) 25% isopropanol (v/v) and 10% acetic acid. 染色：将PVDF膜置于染液中染色数钟，ddH2O 脱色。 2. 考马氏亮蓝染色 染 ...

相关专题 1.确定抗生素作用的最佳浓度：不同的细胞株对各种抗生素有不同的敏感性，因此在筛选前要做预试验，确定抗生素对所选择细胞的最低作用浓度。 ① 提前24 小时在96 孔板或24 孔板中接种细胞8 孔，接种量以第二天长成25%单层为宜，置CO2 孵箱中37℃培养过夜。 ② 将培养液换成含抗生素的培养基， 抗生素浓度按梯度递增0(50 10 ...

相关专题 Northern Blotting技术专题 1. 取RNA 2. 将电泳槽和板，梳齿浸泡在3%H2O2中20-30分钟，并吹干 3. 跑1%琼脂糖凝胶，检测样本RNA含量 4. 变性胶 在桌面上利用保险膜铺出一块干净的区域，将1.95g 琼脂糖加入110ml 的 DEPC-H2O (加热前可在三角瓶上做一个记号，在加热后把蒸发的水分 ...

相关专题 western blot中膜的选择是实验成功的关键点，Western blot实验中一般可以选择硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜，那NC膜和PVDF膜有什么区别呢？怎样才能选择最恰当的杂交膜进行Western blot实验呢？ NC膜 PVDF膜 尼龙膜的特点 解答：尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型;硝酸纤维素膜(NC ...

相关专题 蛋白Marker可分为：一、未预染的Marker即宽分子量蛋白标准、高分子量蛋白标准以及低分子量蛋白标准;二、预染的Marker即单色预染和多色预染。 在western blot过程中，分子量Marker就像个螺丝钉一样没虽然是个小细节，然而就是这样一个小细节对实验结果有着不可忽视的作用。这个 Western Blot参照家族的 ...

相关专题 Western免疫印迹(western blot)是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下western blot技术: 一、原理 二、 分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECLiii.底 ...

相关专题 问：我现在在养细胞，然后收细胞抽蛋白以及提RNA用，我想先多收点细胞冻着。想问一下怎样收集细胞，有具体的流程吗? 我是这样做的： 1、将细胞消化吹打后转移至离心管离心 2、倒去上清，加1 mlPBS打匀后转移至1.5 ml EP管 3、离心12000 rpm 2 min (不知道大家这里用多少转速，有讲究吗?) 4、倒去上清，我是 ...

相关专题 生物实验中的封闭剂 Q：western blot 中脱脂奶粉封闭的是哪些蛋白?原理是什么? A：脱脂奶粉中主要是乳清蛋白和酪蛋白。原理就是用非抗原的蛋白去封闭膜，避免标记抗体固定在膜上引起背景增高。 Q：请问封闭液和抗体稀释液用BSA和脱脂奶粉有什么区别呢? 有人跟我说奶粉的封闭效果更好些，但是通常只能用于WesterBlot，如果 ...

相关专题 生物实验中的封闭剂 杂交膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景，一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。最常见的封闭剂是BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和 ...

相关专题 用于检测重组DNA，也可分析DNA样品中是否有与探针序列同源的DNA片段。用于基因诊断，也可验证检测片段的分子量大小。将基因组DNA经限制性内切酶酶切，进行琼脂糖电泳，把分离后定位在凝胶上的不同分子量的DNA经碱变性处理，将凝胶中变性的DNA转移至一固相支持滤膜。利用标记的某一DNA、RNA或寡核苷酸与固着于滤膜上的DNA发生同源 ...

相关专题 蛋白质的检测与分析――western blot 操作步骤 一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除ELISA法外，也可用与检测DNA和RNA相类似的吸印方法。前两法有“南”和“北”之意，故本法遂被延伸称为Western(西)印迹法，该法能用SDS聚丙烯酰胺凝胶 ...

相关专题 1. 30%储备胶溶液： 丙烯酰胺(Acr) 29.0g　　　　　　　　　　　亚甲双丙烯酰胺(Bis) 1.0g　 混匀后ddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。 2. 4×分离胶缓冲液(1mol/L Tris-HCl PH 8.8) Tris 18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 8.8，定容至100ml ...

相关专题 Western免疫印迹(western blot)是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗 ...

相关专题 在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体(膜)上。膜的选择：印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。我们选用PVDF(聚偏二氟乙烯)，其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。 有两种规格：Immobilon-P(0.45um)和Immobilon-PSQ(0.2um for MW A ...