PCR引物设计

第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。 随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5'末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引 ...

增加PCR的特异性： 1. prime理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件a. 足够长18-24bp以保证特异性.当然不是说越长越好太长的引物同样会降低特异性并且降低产量b. GC% 40%~~~~60% c. 5'端和中间序列要多GC以增加稳定性 d. 避免3'端GC rich 最后3个ｂａｓｅ不要有GC或者最后5个有3个不要是GC e. 避免3'端的互 ...

与许多一次做数百块Southern blots的研究人员一样，我第一次用PCR做基因分型（genotyping）时觉得见效很快，不再需要等几天才能看到结果，不再需要DNA显微图像或者操作紫外线了。随着技术的不断进步，RCR使基因组学和转录组学发生了翻天覆地的变化，甚至随着免疫PCR的普及开始进军蛋白组学。目前有许多以RNA为基础的基因分型技术，有些只是名称不同，简单到只是跑块胶，有些很复杂，需要检 ...

We routinely produce dsRNA by in vitro transcription of a PCR generated DNA template containing the T7 promoter sequence on both ends (I. Primer Designed dsRNA). It is also possible to produce dsRNA u ...

一. 样品的制备1. 设计引物。用Oliga6.0对目的基因进行分析，设定引物，引物长度18-21个碱基，扩增片段以200-300bp最为合适。2. PCR扩增并检测。根据不同的引物挑选适合的退火温度进行PCR扩增。扩增产物用2-2.5%的琼脂糖胶跑水平电泳检测，上样量3-5ul。PCR产物为10ng/nl左右为最佳。3. PCR产物与变性buffer混合。在干净的PCR管底部加入5ulSSCP ...

1. Pull out eight glycerol stock plates from the �80oC freezer and set on bench top to thaw. Be sure to remove the foil seal before leaving the plates to thaw.2. Master mix:Per 100ul RXNFor one 96 ...

Troubleshooting discussion is based on the PCR protocol as described in the table below. All reactions are run for 30 cycles.COMPONENTVOLUMEFINALCONCENTRATION1.autoclaved ultra-filtered water (pH 7.0) ...

For quantifying mRNA we use a competitive RT-PCR protocol with internal standard RNAs. These are added in a defined quantity to the RNA sample prior to the RT reaction. The resulting standard cDNA is ...

Andrea J. GossettandJason D. Lieb1 Department of Biology University of North Carolina at Chapel Hill Chapel Hill NC 27599 USA1Corresponding author (jlieb@bio.unc.edu)INTRODUCTIONKnowledge of the DNA ...

Make DNA templates via PCRDay 1It's preferable to start with constructs that contain RNA polymerase start sites (T3 T7 or SP6) which allow use of primers outside the start-point. This gives the enzyme ...

1. For each PCR reaction (50 µL) prepare a 1.5mL microcentrifuge tube containing the following: - 5 µL of 3M sodium acetate (NaOAc) pH 4.6 - 100 µL of 95% ethanol (EtOH) 2. Pipet the ent ...

human actin f ctc cat cct ggc ctc gct gt human actin r gct gtc acc ttc acc gtt cc product size:268 rabbit actin r agt gcg acg tgg aca tcc g rabbit actin f tgg ctc taa cag tcc gcc tag product size:295 ...

自从1985年美国PE―Cetus公司的人类遗传研究室 Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(PCP0 以来，PCR已经成为了分子生物学领域最基本也是最重要的技术手段之-1 引物的设计以及初步筛选引物的设计与初步筛选基本上通过一些分子生物学软件和相关网站来完成的， 目前运用软件Primer Premier 5 或美国 whitehead 生物医学研究所基因组研究中心在因特网上提供的一款 ...

1．简介 寡聚核苷酸引物的选择，通常是整个扩增反应成功的关键。所选的引物序列将决定PCR产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。引物设计也极大的影响扩增产量：若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。 ...

DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD(Random amplified polymorphic DNA ，随机扩增的多态性DNA)。尽管RAPD技术诞生的时间很短 但由于其独特的检测DNA多态性的方式以及快速、简便的特点使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。该RAPD技术建立于PCR技术基础上它是利用一系 ...

一、实验目的1．学习PCR基因扩增的基本原理和操作方法。2．理解PCR基因扩增在分子生物实验技术中的重要性。3．了解引物设计的一般要求。二、实验原理多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction PCR )：原理类似于DNA的变性和复制过程，即在高温（93-95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引 ...

在实验室进行分子克隆实验时，经常需要合成大量的引物，而这些合成的引物首先要进行适当的稀释才能使用。如果不稀释就使用引物，往往造成引物的浪费和过早的活性丧失，更有一些被污染而不能使用。因此，建议对合成的引物先进行稀释，然后使用。稀释的引物利于保存和应用。现将方法简单叙述如下：1. Oligo DNA是以OD260单位来计算的，这是指在1ml体积1cm光程标准比色皿中，260nm波长下吸光度为1A26 ...

近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术二基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法人多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法， ...

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【实验目的】1、掌握引物设计的基本要求，并熟悉使用Primer premier5.0软件进行引物搜索。2、掌握使用软件oligo6.0对设计的引物进行评价分析。【实验原理】一、引物设计原则聚合梅链式反应（polymerase chain reaction）即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法，故又称基因的体外扩增法。PCR技术已成为分子生物学研究中使用最多，最广泛的手段之 ...