PCR引物设计

一、利用ncbi搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白)，在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。二、对所找到的序列进行多序列比对将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，可 ...

PCR:We generally use 1-2 ul of starting paraffin microdissected DNA for each 50 ul DOP-PCR reaction.We assume that about 1 ug of product is produced in each DOP-PCR reaction. The entire product is the ...

克隆PCR产物1)克隆PCR产物的最优条件是什么？最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液 50ng质粒DNA1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4oC过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4oC过 ...

PCR反应体系与反应条件　标准的PCR反应体系：　　　　　　 10×扩增缓冲液 　 10ul　　　　　　 4种dNTP混合物 　 各200umol/L　　　　　　 引物 　　　　 　 各10～100pmol　　　　　　　 模板DNA 　　　 　0.1～2ug　　 　　　　　Taq DNA聚合酶 　 2.5u　　　　　　　 Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L　　　　　　 加双或三蒸水至 　10 ...

各位先生，各位女士，各位来宾，各位领导，各位海外侨胞，港澳同胞，欢迎参加两位新人的结婚晚会哦 啊 拿错了， 这是我明天参加婚礼的发言这个才是各位战友 我们来聊聊PCR ：）PCR可以说是目前分子生物学实验中应用最为广泛的一种技术。从最初的在几个水浴锅里把试管放来放去，到现在各种先进的PCR仪， 到REAL TIME PCR。 设备是越来越先进，方法是越来越多，但基本的原理还是那套。然而实际操作中， ...

PCR产物的电泳检测时间　　一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失 ...

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污 染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生.一、污染原因　　(一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于 密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提 取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶 或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染 ...

聚合酶链反应（PCR）技术的发展和应用 第一节　概述　　聚合酶链反应或多聚酶链反应（Polymerase Chain Reaction PCR），又称无细胞克隆技术(“free bacteria”cloning technique)，是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。该方法一改传统分子克隆技术的模式，不通过活细胞，操作简便，在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增1 ...

第八章 聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆第一节 概 述　　PCR(Polymerase Chain Reaction聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Exte ...

一、组织抽提：1. 取组织块50-100�用液氮在研钵中研磨成粉末2. 移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆3. 移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打4. 冰上孵育5分钟5. 离心12000g 4℃ 5分钟 取上清液移入1.5ml新离心管6. 加0.2 ml氯仿，震荡，冰上孵育5分钟7. 离心0 ...

　PCR的假阳性问题深受重视，但我个人认为PCR假阴性问题相对于临床检测更为严重。其实PCR假阳性的问题是比较单纯的，一般仅涉及污染和引物的非特异性问题。而污染可以通过严格的实验室管理，合理的环境设置，以及加入UNG酶抗污染基本可以解决，而引物的非特异性问题基本属于厂家试剂质量问题。而PCR的假阴性却不同，它涉及了与PCR实验的几乎所有人员和技术环节，十分复杂。就临床而言，大三阳检出率低、甚至于G ...

The DNA Facility houses the “real-time” or kinetic PCR instrument the Applied Biosystems Model 7700 sequence detection system (the TaqMan instrument). The polymerase chain reaction (PCR) has revolutio ...

Why PrimerBank?PrimerBank is a public resource for PCR primers. These primers are designed for gene expression detection or quantification (real-time PCR). There are several ways to search for primers ...

PCR引物设计的11条黄金法则1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在15~30碱基之间。引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温 ...

Degenerate PCRby Michael Koelle 1/6/96Primer Design Graphic The identification of novel members of gene families by PCR using degenerate primers has been considered more of an art than a science so mu ...

Degenerate PCRby Michael KoelleThe identification of novel members of gene families by PCR using degenerate primers has been considered more of an art than a science so much so that the methods books ...

Degenerate Primers For amplification of cognate sequences from different organisms or for "evolutionary PCR" one may increase the chances of getting product by designing "degenerate" primers: these wo ...

IntroductionPolymerase chain reaction (PCR) has rapidly become one of the most widely used techniques in molecular biology and for good reason: it is a rapid inexpensive and simple means of producing ...

The bisulfite reaction reaction was first described in early 1970s and was used by Frommer et al to distinguish between cytosine and 5mCytosine (5mC) in DNA. In this reaction DNA is first treated with ...

Bisulfite Treatment of DNAAdapted from Frommer et.al.*Dilute DNA (up to 2 mg) into 50 ml with distilled H2O. Add 5.5 ml of 2M NaOH. Incubate at 37°C for 10 minutes (to create single stranded DNA). Add ...