PCR技术原理

RFLP－－限制片段长度多态性限制性片段长度多态性（RFLP，Restriction Fragment Length Polymorphism）　　RFLP技术于1980年由人类遗传学家Bostein提出。它是第一代DNA分子标记技术。Donis―Keller利用此技术于1987年构建成第一张人的遗传图谱。DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RFLP(Restriction Fragment Length Polym ...

实时荧光定量PCR 从1996年美国AppliedBiosystems公司推出实时荧光定量PCR技术以来，该技术已经越来越广泛的应用到各类RNA的研究中，成为研究RNA必不可少的实验手段之一。目前比较常用的方法有两种： （1）TaqMan荧光探针法：该方法在特异性探针的两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，荧光基团发光被淬灭基团吸收；在PCR扩增过程中，探针被降解，荧光 ...

DNA纯度的判断根据OD260/OD280的比值判断，符合要求纯度高的纯化DNA其OD260/OD280在1.6~1.8之间，低于此范围表明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA。 一般机器给出的比值是分子分母同时减OD320所得，你可以自己算一下OD260/OD280，如果在要求的范围内，说明你的OD320偏高，即可能有有机物污染，比如酒精未充分挥发。 纠正一下，纯DNA的A260/A ...

随着分子生物学研究发展的不断广泛和深入，PCR已成为一门相当成熟的常规技术，而热聚合酶（即Taq酶）的合理选择是PCR成败与否的一个关键因素。目前市面上有多种Taq酶，能够满足多方面的实验需要。那么，如何选择最合适的Taq酶？根据用户经常考虑的指标，如特异性、保真性、耐热性、扩增速率、扩增片段长度、能否进行复杂模板扩增以及优化条件难易等等，我们在这儿将主要的Taq酶归归类，其性质、用途也就一目了然 ...

1．常规程序将PCR反应所需的成分配置完后，在PCR仪上于94-96℃预加热几十秒至几分钟，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于94℃保持30秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度（一般50-60℃之间），一般保持30秒钟，使引物与模板充分退火；在72℃保持1分钟（扩增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环。重复这样的循环25～35次，使扩增的DNA片段 ...

什么是PCR实验的灵敏度?灵敏度指的是PCR扩增反应能够检测到目的基因的最小值。研究结果表明，影 响PCR扩增效率的因素，如模板的复杂程度与完整性、引物的纯度及其与模板的结合效率、反应温度、DNA聚合酶的热稳定性与扩增性能、反应缓冲液的离子组 成（主要指阳离子）、反应优化剂等等，都决定了PCR实验的检测灵敏度。在最佳的扩增条件下，常规PCR反应能够检测到的pg(10-12g)数量级的目 的基因。对 ...

一、实验目的 1.掌握聚合酶链式反应的原理。 2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。 二、实验原理 PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子 ...

一、DNA聚合酶的选择 实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa TaqTM，TaKaRa EXTaqTM和 PyrobestTMDNA Polymerase。TaKaRaTaqTM是一般的DNA 聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRaEXTaqTM是具有 Proof reading活性的耐热性 DNA聚合酶，具有一定的保真性，而 ...

PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。 平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头；PCR产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR产物也可不加处理。如果使 ...

1、引物设计 细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点： ① 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错 ...

一、拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 原因： 1.模板不纯 2.Buffer不合适 3.退火温度偏低 4.酶量过多 5.dNTP、Mg2+浓度偏高 6.循环次数过多 对策： 1.纯化模板 2.更换Buffer 3.适当提高退火温度 4.适量用酶 5.适当降低dNTP和镁离子的浓度 6.减少循环次数 二、假阳性 现象：空白对照出现目的扩增产物 原因： 靶序列或扩增产物的交叉污染 对策： ...

一、实验目的 1．学习PCR基因扩增的基本原理和操作方法。 2．理解PCR基因扩增在分子生物实验技术中的重要性。 3．了解引物设计的一般要求。 二、实验原理 多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction PCR )：原理类似于DNA的变性和复制过程，即在高温（93-95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成 ...

PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 一.假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过 ...

Life Technologies公司近日宣布推出了TaqMan®Mutation Detection Assays。这是一个高度灵敏且新颖的研究工具，能够检测到隐藏在100万个正常拷贝的背景之下的单个突变分子。它的核心是castPCR-等位基因特异的TaqMan聚合酶链式反应。

荧光定量PCR检测技术诞生至今已10多年的时间，而其应用一直都没广泛展开，究其原因，无外乎受制于相关仪器、试剂和技术的发展。近期，尤其是08年以来，仪器和试剂是遍地开花，这也使科研人员均跃跃欲试，都想借此技术使自己的研究能突飞猛进，发展势头通过查找每年所发表的文章数可一目了然。

PCR 基本原理 PCR实际上是通过引物延伸核酸的某个区域而进行重复双向DNA合成，是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法其特异性由引物序列决定。 PCR扩增一个模板需要一对寡核苷酸引物、4种脱氧核糖核苷酸（4dNTP）、摩尔数超过dNTP的镁离子和进行DNA合成的耐热的DNA聚合酶。一般情况下这两段寡核苷酸引物分别与模板DNA上待扩增DNA区段两侧的一段序列互补，并能进行特 ...

1、变性温度和时间：模板DNA和PCR产物的变性不充分是PCR失败的主要原因。适宜的变性条件是95℃ 30s或97℃15s。变性不完全，DNA双链会很快复性因而减少产量。在变性中温度太高或反应时间过长会导致酶活性的损失。Taq　DNA聚合酶活性的半寿期:92.5℃为2h以上，95℃为40min，97℃为5min。 2、复性温度和时间：复性温度决定PCR的 ...

PCR反应体系的污染的对策 PCR可从痕量的DNA扩增出大量的DNA产物，由于它的高度敏感性，使PCR也特别容易受到污染。如果一对引物多次使用或以靶序列扩增产物的有无作为诊断的标准，那么必须消除污染以得到有意义的PCR结果。污染的DNA可能有三个来源：来自其他测试样品的DNA，来自实验材料如重组克隆的DNA，或者来自同一靶序列的前一次PCR的扩增产物。最后一种污染，通常称为“遗留”（car ...

全血标本DNA PCR反应模板的制备 【试剂与配制】蛋白酶K：20mg/L 溶于10mmol/L Tris-HCl pH7.5TE缓冲液（pH7.5 或8.0）PBS（磷酸盐缓冲液）钾缓冲液：50mmol/L KCl，10～20mmol/L Tris-Cl，2.5mmol/L MgCl(pH8.3)， 1%laureth12，0.5 ...

微量和特殊标本DNA PCR反应模板的制备（一）血斑标本【操作方法】　（1） 将血斑剪碎置于试管中；（2） 加1.8ml TES液(含0.15mol/L NaCl10mmol/L Tris-HClpH7.51mmol/L EDTA)浸泡10min；（3） 加10％ SDS 180μl和蛋白酶K(10U)25μl50℃过夜；（4） 用等体积的饱和酚和氯仿各抽提两次；（5） ...