PCR技术原理

原理：(1) PCR特点：扩增片段大小由2条引物与模板的结合位点决定；经过PCR扩增，产物以指数级数增加，达到目的片段的大量扩增。(2) Taq DNA聚合酶简化并推动了PCR的发展：水生栖热菌（Thermus aquaticus）,75OC温泉半衰期：95OC 38分钟最适温度：72OC，耐高温特性使PCR反应的特异性增加。(3) 各种来源的DNA都可以作为PCR扩增的模板DNAmRNA cDNAcDNA文库或DNA文库细胞直接煮沸(4) PCR的 ...

标准的PCR反应体系：　　　10×扩增缓冲液 　 10ul　　　4种dNTP混合物 　 各200umol/L　　　引物 　　　　 　 各10～100pmol　　　　模板DNA 　　　 　 0.1～2ug　　 　 Taq DNA聚合酶 　 2.5u　　　　Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L　　　加双或三蒸水至 　 100ulPCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+　　引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物， ...

http://fileho.com/download/a42426471683/PCR-TECHNOLOGY-Current-Innovations--SECOND-EDITION.rar.htmlPCR Technology: Current Innovations, Second Edition is a fundamental reference for scientists new to PCR technology and a source of up-to-date applicati ...

因工作需要，想查一下最原始的有关PCR论文，在PubMed上，用（“Polymerase chain reaction”）搜索了1984-1987年的论文，结果有11篇，其中最早的在1986年发表，共3篇，具体如下：9: Saiki RK, Bugawan TL, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. Related Articles, LinksAnalysis of enzymatically amplified beta-globin and HLA-DQ alpha DNA with ...

PCR技术概论聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便 ...

分子克隆技术步骤在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。克隆在生物学中其名词含义系指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同 ...

终于把一批小鼠样品的荧光定量实验做完了，可以松口气了。期间吃过亏，也学到了很多经验。今天刚好有时间，就把这些经验写下了，跟大家分享交流，希望对跟我有相同经历的人有所帮助。先说说我吃的亏吧： 提取小鼠心脏RNA，做逆转录，然后用逆转录的CDNA做Real-time PCR。最后发现，Real-time PCR结果CT值都很大，连内参的CT值也超过了32。 当时看到这个结果就懵了。别人的Real-time PCR结果我见过，CT值一般在30 ...

Setup of a PCR LaboratoryAbstractPCR represents an extremely powerful and central molecular biology method. At the heart of its poweris the exquisite sensitivity offered: single molecule detection in certain contexts. However, with greatpower comes great responsibility. Con ...

Single-cell RT-PCR单细胞RT-PCR技术创立于1991年，随着时间发展，其技术不断完善，在神经生物学、胚胎发育、免疫学等领域都有进一步发展。1.单细胞的获得第一步是获得单个完整的细胞，注意：快速精确操作，尽量减少在操作中由于外界刺激和时间过长引起的细胞表达上的改变，以及外源RNA和RNA酶的污染；目前常用方法有膜片钳技术，激光显微切割技术（LCM），显微吸管操作和流式细胞仪（FACS）。膜片钳技术是在单细 ...

Question

This procedure was first described by Bertrand et al (Proceedings of the National Academy of Science USA (1993) Vol. 90 pp. 3496-3500, and Nucleic Acids Research (1994) Vol. 22 pp. 293-300) to demonstrate that ribozymes could be enzymatically active in vivo. We adapted the method to show that certain o ...

This protocol uses C. therm. Polymerase One-Step RT-PCR system from Roche. 1. Setup master mix 1: 25 mM dNTP0.8 mlDMSO2.5 ml100 mM DTT2.5 mlRNase Inhibitor (40 U/ml)0.5 mlf

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Detection of Alu by PCRA Human DNA Fingerprinting Lab Protocol1994 Cold Spring Harbor LaboratoryDNA Learning CenterIn this experiment, polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify a nucleotide sequence from chromosome 8 to look for an insertion of a short DNA sequence called Alu wit ...

M13 Forward(-20)5’d3’M13 Forward(-40)5’d3’M13 Reverse5’d3’T7 Promoter5’d3’T3 Promoter5’d3’Sp6 Promoter5’d3’M13/pUC Reverse5’d3’M13/pUC Forward5’d3’ 上一篇：如何设计引物 下一篇：实时PCR/RT-PCR解决方案

a) Primers: i) Oligonucleotide primers are generally supplied as "so many OD units/ml" - but what does this mean, in terms of mg/ml, or mmol/ml, etc? Given: a primer is Y nucleotides (nt) long; Given: the MW of ssDNA is (330 daltons per nt) x (length in nt) (Sambrook et al., 1989; p. C.1); Given: the concentration of primer (=ssD ...

Materials: Taq (or other) PCR enzyme (5 Units/ul) PCR enzyme reaction buffer Distilled water (nuclease free) DNA to be used as template, such as GAPDH template from Clontech DNA to be used as upstream and downstream primers, such as the corresponding primers set for GAPDH template from Clontech Lig ...

Materials: sterile water10X amplification buffer with 15mM MgCl210 mM dNTP50 μM oligonucleotide primer 150 μM oligonucleotide primer 25 unit/μl Taq Polymerasetemplate DNA (1 μg genomic DNA, 0.1-1 ng plasmid DNA) in 10 μlmineral oil (for thermocyclers without a heated lid 1. Combine the fo ...

聚合酶链式反应（PCR） 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复 ...

问 题可能原因建议解决方法RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物RNA被降解在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。RNA中包含 ...