PCR技术原理

随着分子生物学技术的发展，检测基因结构和突变的方法不断涌现。尤其是PCR技术问 世以后，各种与PCR相结合的基因检测技术进一步推动了基因研究的发展。如不对称 PCR产物的直接测序、核糖核酸酶酶切法(Ribonuclease cleavage，RNAase)、限制性 片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)等等已成 为基因分析的 ...

进化遗传学具有两个并列的研究方向：系统发育的重建和种群分析。自1962年， Zuckerkandl和Pauling提出蛋白质序列和基因序列的比较可以象分子种一样用于标志 现存物种分化的时间以来，各种生化方法被用于系统发育的研究。在最初二十年内， 同功酶的电泳分析、免疫学比较和蛋白质序列分析被广泛地应用。而最近，DNA-DNA 杂交和核糖体RNA序列分析为分类学做出了重要贡献。这些技术大多有局限性， ...

描述一种大聚合酶链反应(PCR)应用的方法，使在已知序列的核心区边侧的未知 DNA成几何级数扩增。用适当的限制性内切裂解含核心区的DNA，以产生适合于PCR扩 增大小的片段，然后片段的末端再连接形成环状分子。PCR的引物同源于环上核心区 的末端序列，但其方向性，使链的延长经过环上的未知区而不是分开引物的核心区。 这种反向PCR方法可用于扩增本来就在核心区旁边的序列，还可应用于制备未知序列 探针或测 ...

高等生物遗传图谱的构建依赖于选择性杂交后代的分析或者通过家系分析法来计 算连锁关系。对人类而言仅后者是可行的。使用长度多态性限制片段（RFLPS）在构 建人连锁图谱方面已取得长足的进步。为了对带有与已知表现型相关的RFLP标记的基 因进行定位，首先得建立间隔约10CM的遗传标记束（平均1CM等于1％重组），这样没 有基因离标记RFLP的距离会超过5CM.可靠的统计表明家系分析能够检测的遗传间距 精 ...

PCR技术代替了为测序而反复进行的分子克隆和模板制备步骤。PCR技术与自动测 序技术相结合后，它将成为一种最快、最有效的测定核苷权序列的方法。本章主要综 述各种测模板的制备以及如何完成PCR产物的直接测序。与传统的将PCR片段克隆入质 粒或病毒基因组相比，直接序列分析有两个主要的优点:1)由于它是一个不依赖于生 物体(如细菌、病毒等)的体外系统，因而它更容易标准化(即例于自化2)；对于每个待 测样 ...

最常用的基因分离方法需要建立组织或细胞RNA的cDNA库，然后用抗体或 DNA探针筛选出感兴趣的基因。虽然这个方法已成功地克隆了大量基因，但建立和筛 选CDNA库是一项非常耗时。费力的工作，而且用寡聚核苷酸作探针进行筛选需大量蛋 白质序列结构的资料。聚合酶链的反应（PCR）方法可使一种特异DNA扩增几百万倍， 并已成为分子克隆和诊断的十分有用的工具。最近，TAQDNA聚合酶的使用极大地简化 了PC ...

RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。 可能原因： 1、RNA被降解 建议解决方法 在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA； 在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA； 如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase.而且，在≥0.8mM DT ...

热启动PCR 热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如site-directed突变、表达克隆或用于DNA工 ...

1、引物设计由美国Perkin-elmer公司合成，引物末端标记有生物素。 （1）扩增体系 10×PCR buffer 5μl PCR引物&n ...

多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称PCR技术，是80年代中期发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。此法操作简便， 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的DNA序列的拷贝，PCR技术虽然问世仅数年时间， 但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命. 目前它在分子克隆， 目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广 ...

Designing PCR primers 1.length of individual primers between 18-24 bases. Longer primers (30-35 bp) seem to work in more similar cycling conditions compared with shorter primers and can make multiplex ...

1.DMSO and glycerol Recommended by a number of authors to improve amplification efficiency and specificity of PCR. Howeverin the multiplex reaction these enhancers gave conflicting results.For example ...

1.Introduction Polymerase chain reaction (PCR) has rapidly become one of the most widely used techniques in molecular biology and for good reason: it is a rapid inexpensive and simple means of produci ...

1.protocol (1)collect piece of tissue (e.g. pieces of a leaf or flower) in Eppendorf tube containing 40 ml 0.25 N NaOH (2)put in boiling H2O for 30 sec (optimum may need to be determined for each type ...

PCR反应的关键因素主要有引物的选择与设计，酶的质量。模板的制备，在前二者都稳定可行的情况下，PCR模板的制备尤为重要。模板处理方法的选择及操作人员的基 本技能，决定分离模板核酸(DNA或RNA)的质和量及PCR的成败。而提高模板核酸质量的 关键是除去杂质(蛋白质、酶、脂肪等)。除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子，提高模板核酸的产量。 传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如SDS ...

Nature of the Insert The cloning of PCR-amplified fragments into a linear vector is typically a rapid and efficient process. However not all PCR fragments will clone with the same efficiency into the ...

A commonly used PCR buffer includes only KCl Tris and MgCl2 (for examplePerkin Elmer Cetus);a somewhat more complex buffer was previously proposed for multiplex reactions of the DMD gene exons (Chambe ...

Materials: sterile water 10X amplification buffer with 15mM MgCl2 10 mM dNTP 50 μM oligonucleotide primer 1 50 μM oligonucleotide primer 2 5 unit/μl Taq Polymerase template DNA (1 μg genom ...

Polymerase Chain Reaction 1) Add the following to a microfuge tube: 10 ul reaction buffer 1 ul 15 uM forward primer 1 ul 15 uM reverse primer 1 ul template DNA 5 ul 2 mM dNTP 8 ul 25 mM MgCl2 or MgSO4 ...

Software for: Making Restriction Maps Designing PCR primers Assembling fragments detecting SNPs and managing raw sequence data For:GCGMacPCUNIXand on the Web Restriction Mapping -Making restriction ma ...