生物界的丰富多彩很大程度上取决于严格调控下的基因的选择性表达。高等生物的细胞内约含有105个不同的基因,而主 基因在某个特定的细胞中,只有占15%的一小部分表达。而且在不同的细胞中,选择性表达的基础也是不同的。正是这些基因的选择不同决定了整个生命的过程:如细胞的生长分化,激素和细胞困子对细胞的作用、细胞周期的调控以及衰老、死亡等。和细胞的正常生理一样,一些病理的反应如肿瘤等也是由基因表达的改变引起 ...
PCR技术自1985年建立以来,发展之迅速、应用之广泛,表明其具有强大的生命力。近些年来,基于PCR的基本原理,许多学者充分发挥创造性思维,对PCR技术进行研究和改进,使PCR技术得到了进上步地完善,并在此基础上派生出了许多新的用途。 原位PCR技术 原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应,它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点,是细胞学科研与临床诊断领 ...
凝胶电泳分琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种. 一、琼脂糖凝胶电泳: 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和 鉴定核酸的方法.琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物.根据琼脂糖的溶解温度, 把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖.低熔点琼脂糖熔点为62~65℃,溶解后在 37℃下维持液体状态约数小时,主要用于DNA片段的回收,质粒与外源性DNA的快速连 接等. (一)凝胶浓度 凝胶浓度 ...
Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的。yT是 一种嗜热真菌,能在70~75℃生长。该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉 中分离的。 (一)酶活性与热稳定性 该酶基因全长2496个碱基,编码832个氨基酸,酶蛋白分子为 94KDa。其比活性为200000单位/mg。75~80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷 酸,70℃延伸率大 ...
PCR反应的关键因素主要有引物的选择与设计,酶的质量.模板的制备,在前二者都稳定可行的情况下,PCR模板的制备尤为重要.模板处理方法的选择及操作人员的基 本技能,决定分离模板核酸(DNA或RNA)的质和量及PCR的成败.而提高模板核酸质量的 关键是除去杂质(蛋白质、酶、脂肪等).除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子,提高 模板核酸的产量. 传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如SDS等来破坏细 ...
一般PCR方法在扩增大片段DNA时的局限性: 通常所用的PCR方法都在两个方面有局限,即目标产物精确程度和合成片段的大小。Pfu(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶,具有完整的3'外切酶校读活性(3'-editing-exonuclease),可以将每个循环中碱基的错配率由1undefined-4降到1undefined-3,从而提高PCR产物的准确性。但它在扩增1.5-2.0kb片段时,效率比Klenta ...
PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作为引物,通过加温变性-退火-DNA合成这一周期的多次循环,使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的,经25-30个循环后,扩增倍数可达106。Dr. Karry Mullis 1985年发明,获1993年度诺贝尔化学奖; (二)基本要素 1、Taq DNA聚合酶: 水生栖热菌(thermus a ...
一滴残留在裙子上的精液使得美国总统Bill Clinton不得不坦承他与白宫实习生有不正当的关系。因为他知道现在的生物科技就连一个精子也能被用来做为证据。这种将极微量的生物标本化为可供鉴定的现代技术正是PCR(Polymerase chain reaction)--聚合酶链式反应具有的特色之一。这也是分子生物医学令人震撼的一例。 何谓PCR 简单的说,PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试 ...
1、导论 多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction PCR)是美国Perkin-Elmer/Cetus公司人类遗传研究室Mullis K. B.等人于1985年发明的一种快速体外DNA片段扩增技术,是八十年代分子生物学资源领域的一项革命性突破,被誉为分子生物学资源发展史上的又一里程碑。该技术一问世,就在分子生物学、医学、生物工程、法医学、考古学等领域得到快速而广泛的应用, ...
1、问题:RT-PCR灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。 可能原因: 1)RNA被降解 建议解决方法: 在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA; 在将组织从动物体取出后立刻处理在100%甲酰胺中储存RNA; 如果使用胎盘RNase抑制剂,不要加热超过45℃或pH超过8.0,否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且,在≥0.8mM ...
Recommended Reagent Concentrations: Primers: 0.2 - 1.0 uM Nucleotides: 50 - 200 uM EACH dNTP Dimethyl sulphoxide (DMSO): 0 - 10% (v/v) Taq polymerase: 0.5 - 1.0 Units/50ul rxn Target DNA: 1 ng - 1 ug ...
Cloning PCR Products T-A Cloning Strategy: Taq and other polymerases seem to have a terminal transferase activity which results in the non-templated addition of a single nucleotide to the 3'-ends of P ...
Labelling PCR Products with Digoxigenin PCR products may be very conveniently labelled with digoxigenin-11-dUTP (Boehringer-Mannheim) by incorporating the reagent to 10-35% final effective dTTP concen ...
From: Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends. Eds. A.M. Griffin and H.G.Griffin. ISBN 1-898486-01-8 1995 Horizon Scientific Press PO Box 1 Wymondham Norfolk U.K. In vitro site-dire ...
The following colony PCR protocol has been designed to be performed in individual reaction tubes. We usually test three colonies from each transformation along with a wild-type control. A series of fi ...
Description Single primer PCR allows amplification from known to unknown regions in chromosomes phage plasmids large PCR products and other sources of DNA. At sufficiently low stringency any primer wi ...
1、反应体系 25ulCocktail 20 ul: Primer FP 1 ul + Primer RP 1u + 2 * SYBR GREEN I MIX 12.5 + H2O 5.5 ul cDNA 5 ul 2、Primer 浓度,需要摸索,从200nM到700nm等,设置不同浓度。 3、每个引物浓度,从well 1到12设置4个样本,阳性cDNA 1和2,NTC以及H2O,做tripli ...
Q: Does the PCR reaction volume (negatively) influence the outcome? A: No especially since the introduction of the small thin walled 0.2 ml plastic vials fitting the 96 well metal blocks of the thermo ...
After an aliquot of the PCR mixture is analyzed on an agarose gel the remainder of the reaction is concentrated by ethanol precipitation resuspended in buffer and subjected to a simultaneous fill-in/k ...
"Hot Start" PCR: In certain circumstances one wishes to avoid mixing primers and target DNA at low temperatures in the presence of Taq polymerase: Taq pol is almost as efficient as Klenow po ...